自1978年第一例试管婴儿在英国诞生以来,人类辅助生殖技术发展至今已有40余年,体外受精-胚胎移植（IVF-ET）技术的临床妊娠率和抱婴回家率逐步提高,其中胚胎的发育潜能是IVF-ET能否成功获得妊娠的重要影响因素之一。目前主要通过形态学的方法来判断胚胎的发育潜能,但形态学的方法容易受观察者的主观因素影响,近年来有研究者通过检测胚胎的代谢水平来量化评估胚胎的发育潜能,即通过检测胚胎摄取的特殊营养物质和分泌的特殊代谢产物及因子量化胚胎的发育潜能[1]。胚胎培养液作为胚胎生长发育的环境,能够为胚胎提供水、离子、能量物质、氨基酸、维生素、核酸前体、蛋白质、生长因子激素、缓冲系统,在胚胎培养过程中,理论上在胚胎发育的关键节点目标代谢物的变化能够反映胚胎的代谢能力、发育潜能以及着床能力,故胚胎培养液的成分能够作为胚胎质量的生物标记。有研究者使用高效液相色谱法（HPLC）检测胚胎培养液,结果显示氨基酸水平与胚胎移植后妊娠结局有关[2,3,4]。行IVF-ET治疗患者的年龄不同,其妊娠结局往往也不一样,既然胚胎的氨基酸代谢可以预测胚胎的发育潜能,由此推测不同年龄患者的胚胎其代谢可能也不一样,但是目前不同年龄患者胚胎的氨基酸代谢规律尚不清楚。本研究使用HPLC法检测胚胎的氨基酸代谢,比较胚胎的氨基酸代谢在不同年龄患者之间的差异,揭示不同年龄患者胚胎的氨基酸代谢规律,旨在为改善胚胎培养环境、获得更优质胚胎从而提高IVF-ET的成功率提供依据,现报告如下。
对象与方法
一、研究对象
2018年2月至2018年12月在佛山市第一人民医院生殖中心接受IVF-ET治疗的患者,收集符合纳入条件的体外培养新鲜胚胎的废弃培养液为研究对象。按女方患者的年龄分为< 35岁组、35 ~ 39岁组、≥40岁组,每年龄组各收集20份培养液标本,共60份标本,另外选择同一时期同样培养环境下未培养过胚胎的培养液为空白对照组。本研究中行IVF-ET治疗的患者均符合原卫生部制定的《人类辅助生殖技术规范》 中IVF-ET的适应证,排除有禁忌证者,所有患者均已签署知情同意书。纳入实验的培养液其胚胎符合以下标准：①采用短效长方案或者长效长方案促排卵获得卵子;②因男方因素需采用卵胞浆内单精子显微注射技术（ICSI） 授精;③正常受精的取卵后第3日（D3）胚胎;④患者夫妻双方无代谢性疾病。
二、控制性促排卵
如前纳入标准所述,采用短效长方案或者长效长方案促排卵：于黄体中期（约月经第20日）使用长效或者短效促性腺激素释放激素激动剂（GnRH-a）进行垂体降调节,降调节14 d后使用促性腺激素（Gn）进行控制性促排卵,使用Gn后在阴道B超下监测卵泡的大小,当卵泡直径≥18 mm的优势卵泡有1个以上时或者直径≥17 mm的优势卵泡有2个以上时,于当晚9点30分使用人绒毛膜促性腺激素（HCG）扳机,扳机后36 h在B超引导下经阴道穿刺取卵。
三、精液的处理
取卵日当日按WHO人类精液检查与处理实验室手册（第五版）,使用密度梯度离心及上游法收集前向运动的精子。
四、ICSI授精
穿刺取出的卵母细胞经G-IVF PLUS（Vitrolife G5）培养液冲洗3遍之后,在G-IVF PLUS培养液中培养待授精,培养条件为5% ~ 6% CO2、37℃的培养箱。于注射HCG 38 ~ 40 h后进行ICSI授精。
五、胚胎受精观察及胚胎形态学评分
取卵后的第1日（D1）上午剥除颗粒细胞后,将受精卵单个分别移入CO2平衡好、盖油的G-1 PLUS（Vitrolife G5）培养液微滴中,每个微滴大小约20 μl,在显微镜下观察原核情况,以确定是否受精,如观察到双原核提示正常受精、观察到3个原核为3PN受精。于D3上午观察胚胎的卵裂情况并进行形态学的评分,具体评分及分级标准参考文献[5]。选择正常受精的D3胚胎,其形态学中卵裂球数目6 ~ 10个、大小均一,碎片< 20%,收集培养过这些胚胎的废弃培养液,并收集同一时期同样培养箱同样培养环境下同一培养皿中未培养过胚胎的培养液为空白对照。
六、样本检测
标本收集好后在-20℃冰箱暂时储存,运送至中国广州分析测试中心的色谱实验室,使用高效液相色谱仪（Agilent,1100型）检测标本中20种游离氨基酸的含量,检测的方法为柱前衍生反相高效液相色谱（HPLC）法,具体参见文献[6]。HPLC的色谱条件：使用Hypersil ODS 色谱柱（Agilent）,规格为4.0 mm×125 mm,粒径5 μm;流动相A的成分为10 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4+pH7.2的磷酸盐缓冲液（PBS）,含0.5%四氢呋喃（THF）;流动相B的成分为PBS+甲醇+乙腈（体积比50∶35∶15）;线性梯度0 ~ 25 min,流动相B以线性从0%上升到100%;流速1.0 ml/min,色谱柱的温度为40℃;检测波长0 ~ 20.5 min,激发波长340 nm,发射波长450 nm,主要检测一级氨基酸的衍生物;20.5 min后,将波长切换至激发波长260 nm,发射波长305 nm,此时检测二级氨基酸（脯氨酸）的衍生物。根据每种氨基酸在色谱柱上停留的时间不同将氨基酸依次分开。
七、氨基酸含量计算
八、统计学处理
所有数据使用SPSS 25.0进行分析。符合正态分布的计量资料采用$\bar{x}\pm s$表示,组间比较采用单因素方差分析;非正态分布的计量资料采用中位数（四分位数间距）表示,多组间比较采用秩和检验;总体比较P < 0.05为差异有统计学意义;两两比较采用Bonferroni法,即P < 0.05/3 = 0.017为差异有统计学意义。
结果
一、分组情况
纳入患者年龄为（32.0±2.1）岁,不孕年限为（1.9±0.9）年。< 35岁组、35 ~ 39岁组、≥40岁组中女方患者的BMI分别为（21.7±1.7）、（21.9±1.8）、（22.1±2.1） kg/m2,3组BMI比较差异无统计学意义（P > 0.05）。每年龄组收集20份培养液标本,共60份标本,另外选择同一时期同样培养箱同样培养环境下同一培养皿中未培养过胚胎的培养液为空白对照组,收集20份空白对照标本。所有标本行HPLC检测均显示20种游离氨基酸在25 min内均可出峰,分离效果好。
二、< 35岁组、35 ~ 39岁组、≥40岁组胚胎培养液的HPLC检测结果比较
< 35岁组、35 ~ 39岁组、≥40岁组胚胎培养液中天冬氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、苏氨酸、组氨酸、丙氨酸、牛磺酸、丙氨酰谷氨酰胺、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、色氨酸、异亮氨酸、亮氨酸以及赖氨酸等含量比较差异均有统计学意义（P均< 0.05）,见表1。
表1 不同年龄组胚胎培养液中氨基酸含量的比较[中位数（四分位数间距）] 单位：µmol/L |
| 氨基酸种类 | <35岁组（n = 20） | 35 ~ 39岁组（n = 20） | ≥40岁组（n = 20） | H值 | P值 |
|---|---|---|---|---|---|
| 天冬氨酸 | 115（13） | 104（6）a | 113（12）b | 25.097 | < 0.001 |
| 谷氨酸 | 1（1） | 1（1） | 1（1） | 1.653 | 0.438 |
| 天冬酰胺 | 94（22） | 92（10） | 83（21）ab | 10.558 | 0.005 |
| 丝氨酸 | 101（11） | 98（7）a | 97（11） | 10.968 | 0.004 |
| 谷氨酰胺 | 17（14） | 13（2）a | 21（12）b | 20.713 | < 0.001 |
| 甘氨酸 | 99（9） | 94（7）a | 95（12） | 9.078 | 0.011 |
| 苏氨酸 | 380（24） | 363（25）a | 360（53） | 9.173 | 0.010 |
| 组氨酸 | 180（11） | 175（14）a | 168（28） | 10.324 | 0.006 |
| 丙氨酸 | 24（31） | 19（3）a | 29（27）b | 19.592 | < 0.001 |
| 牛磺酸 | 100（12） | 96（9） | 91（12）a | 8.289 | 0.016 |
| 丙氨酰谷氨酰胺 | 854（128） | 913（90） | 810（241）b | 7.176 | 0.028 |
| 精氨酸 | 572（56） | 566（41） | 553（82） | 1.908 | 0.385 |
| 酪氨酸 | 177（16） | 169（11）a | 163（27） | 7.541 | 0.023 |
| 缬氨酸 | 392（24） | 377（24）a | 376（64） | 9.731 | 0.008 |
| 蛋氨酸 | 89（7） | 85（9）a | 81（9）a | 12.866 | 0.002 |
| 色氨酸 | 41（9） | 38（5） | 35（6）ab | 16.327 | < 0.001 |
| 苯丙氨酸 | 186（14） | 180（12） | 180（33） | 5.654 | 0.059 |
| 异亮氨酸 | 379（23） | 360（25）a | 363（40） | 10.400 | 0.006 |
| 亮氨酸 | 388（24） | 371（23）a | 371（58） | 8.507 | 0.014 |
| 赖氨酸 | 373（21） | 357（28）a | 346（53）a | 9.276 | 0.010 |
注：与< 35岁组比较,aP < 0.017;与35 ~ 39岁组比较,bP < 0.017 |
三、< 35岁组、35 ~ 39岁组、≥40岁组胚胎培养液的氨基酸增加量、减少量以及氨基酸转换量比较
3组胚胎培养液的氨基酸增加量接近,但是在氨基酸减少量以及氨基酸转换量上的差异较大。< 35岁组胚胎培养液中氨基酸减少量低于≥40岁组;< 35岁组胚胎培养液中氨基酸转换量低于≥40岁组,见表2。
表2 不同年龄组胚胎培养液中氨基酸含量相对于空白对照组的变化及氨基酸转换量的比较 单位：µmol/L |
| 氨基酸种类 | 空白对照组[中位数（四分位数间距）] | 氨基酸含量变化 | ||
|---|---|---|---|---|
| <35岁组 | 35 ~ 39岁组 | ≥40岁组 | ||
| 天冬氨酸 | 110（11） | 5 | -6 | 3 |
| 谷氨酸 | 1（1） | 0 | 0 | 0 |
| 天冬酰胺 | 97（6） | -3 | -5 | -14 |
| 丝氨酸 | 102（9） | -1 | -4 | -5 |
| 谷氨酰胺 | 12（4） | 5 | 1 | 9 |
| 甘氨酸 | 99（9） | 0 | -5 | -4 |
| 苏氨酸 | 384（29） | -4 | -21 | -24 |
| 组氨酸 | 186（16） | -6 | -11 | -18 |
| 丙氨酸 | 17（6） | 7 | 2 | 12 |
| 牛磺酸 | 102（8） | -2 | -6 | -11 |
| 丙氨酰谷氨酰胺 | 926（132） | -72 | -13 | -116 |
| 精氨酸 | 583（33） | -11 | -17 | -30 |
| 酪氨酸 | 179（12） | -2 | -10 | -16 |
| 缬氨酸 | 400（33） | -8 | -23 | -24 |
| 蛋氨酸 | 91（7） | -2 | -6 | -10 |
| 色氨酸 | 43（4） | -2 | -5 | -8 |
| 苯丙氨酸 | 192（14） | -6 | -12 | -12 |
| 异亮氨酸 | 378（29） | 1 | -18 | -15 |
| 亮氨酸 | 393（29） | -5 | -22 | -22 |
| 赖氨酸 | 387（32） | -14 | -30 | -41 |
| 氨基酸增加量之和 | / | 18 | 3 | 24 |
| 氨基酸减少量之和 | / | 138 | 214 | 370 |
| 氨基酸转换量 | / | 156 | 217 | 394 |
注：当实验组培养液中的氨基酸相对空白对照组减少时用“-”表示,当实验组培养液中的氨基酸含量相对于对照组无变化时用“0”表示;氨基酸转换量为氨基酸增加量和减少量两者绝对值之和 |
讨论
在胚胎的早期发育过程,氨基酸参与了多项重要的生理生化过程,包括为胚胎的生长发育过程例如蛋白质合成提供重要的原料;清除胚胎代谢过程中产生的氨、活性氧以及维持渗透压;谷氨酰胺经三羧酸循环参与形成三磷酸腺苷（ATP）,并为嘌呤的从头合成和嘧啶的合成提供重要的原料碳和氮;甲硫氨酸通过甲硫氨酸循环调节物质代谢,参与DNA的甲基化作用;组氨酸在组氨酸脱羧酶的作用下转换为组胺,组胺可以帮助子宫接受胚胎的种植;精氨酸在一氧化氮合成酶的作用下合成一氧化氮,参与胚胎种植的多个信号调节过程等[7]。
目前有多种氨基酸检测方法,包括色谱学、质谱学、色谱-质谱联用技术等。其中色谱-质谱联用技术可同时定量测定包括氨基酸、有机酸、糖和脂肪酸等化学结构和性质不同的化合物,检测的分辨率以及灵敏度高于一般的方法。本研究采用的HPLC法即为色谱-质谱联用技术,HPLC检测的样本量仅需10 μl,且检测耗时短,在半小时内20种氨基酸可以全部得到良好分离。HPLC分析快速、检出限低、精确性高,是检测胚胎培养液中复杂氨基酸组分的较好方法之一。
本研究中HPLC检测结果表明,< 35岁组、35 ~ 39岁组、≥40岁组患者的胚胎培养液中天冬氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、苏氨酸、组氨酸、丙氨酸、牛磺酸、丙氨酰谷氨酰胺、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、色氨酸、异亮氨酸、亮氨酸以及赖氨酸等含量比较差异有统计学意义。其中< 35岁组的胚胎培养液中天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、苏氨酸、组氨酸、丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸以及赖氨酸等含量高于35 ~ 39岁组。< 35岁患者其胚胎培养液中天冬酰胺、牛磺酸、蛋氨酸、色氨酸以及赖氨酸等含量均高于≥40岁组。35 ~ 39岁组的胚胎培养液中天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丙氨酸、丙氨酰谷氨酰胺以及色氨酸等含量与≥40岁组患者比较差异也有统计学意义。说明患者的年龄不同,其胚胎的氨基酸代谢是有差异的,年龄越大的患者与越年轻的患者相比,有差异的氨基酸种类越多,差异也越大、越明显。有差异的氨基酸中多种氨基酸参与了胚胎的发育及种植等妊娠的关键步骤,例如谷氨酰胺经三羧酸循环参与形成ATP并为嘌呤的从头合成和嘧啶的合成提供重要的原料碳和氮;组氨酸在组氨酸脱羧酶的作用下转换为组胺,组胺与胚胎的种植过程也有关。其他有差异氨基酸可能发挥作用的途径还需进一步研究。
体外培养的胚胎从培养液中摄取氨基酸的同时也会分泌部分氨基酸到培养液中,因此本研究将氨基酸增加量的绝对值和氨基酸减少量的绝对值相加,计算得到氨基酸转换量这一值,能更好体现胚胎的氨基酸代谢规律。本研究中检测结果表明,与空白对照组相比,3组的氨基酸增加量接近,但是在氨基酸减少量以及氨基酸转换量上差异较大。< 35岁组胚胎培养液中氨基酸减少量低于≥40岁组,< 35岁组胚胎培养液中氨基酸转换量也低于≥40岁组。研究结果表明,不同年龄患者的胚胎在氨基酸减少量以及氨基酸转换量上存在差异,且患者的年龄越大,其胚胎的氨基酸减少量和氨基酸转换量越大,与年轻患者相比这种差异也越大。IVF-ET助孕的妊娠结局受多种因素影响,其中年龄是最重要的因素。一般而言,年轻患者的妊娠结局明显好于年龄大的患者。本研究中不同年龄患者的胚胎在氨基酸代谢上存在的差异也证实这一点,氨基酸是胚胎生长发育过程中蛋白质合成的重要原料之一,提示患者年龄越大,其胚胎需要付出更大的努力去适应外界的培养环境,患者年龄越大,其胚胎发育过程中会经历更大的细胞或者分子损伤,胚胎需要消耗更多的营养物质如氨基酸以进行修复,从而体现在其氨基酸代谢即氨基酸减少量和氨基酸转换量的变化越大。
综上所述,不同年龄患者的胚胎在氨基酸代谢上存在差异,且患者的年龄越大,其胚胎的氨基酸减少量和氨基酸转换量越大,与年轻患者相比这种差异也越大,基于这种代谢上的差异,提示我们是否可以根据这一代谢规律,为不同年龄患者设计不同成分的培养液来培养胚胎,满足不同胚胎的不同代谢需求,从而得到具有更好发育潜力的胚胎,最终降低IVF-ET的双胎率、提高活产率以获得更好的妊娠结局,当然这需要进一步大样本量研究以及动物实验去验证。如何提高预测胚胎发育潜能的能力,在减少移植胚胎数目、降低多胎妊娠发生率的同时又保持甚至提高胚胎的种植率和临床妊娠率,仍然是人类辅助生殖领域尚需要解决的一个重要问题。