胃癌是全球常见的恶性肿瘤,其癌症相关死亡率在所有癌症中居第二位,严重威胁着人类的健康和生活质量[1]。目前,腹腔镜胃切除术已被广泛接受为治疗胃癌的一种微创手术[2]。对于早期胃癌,内镜手术,如内镜黏膜切除术（EMR）和内镜黏膜下剥离术（ESD）,也被越来越多的应用于临床[3,4]。尽管如此,无典型体征或轻度典型体征给早期胃癌的诊断带来很大困难,大多数胃癌患者初诊时已经是中晚期。早期胃癌的5年生存率可达到90%,而中晚期胃癌患者的5年生存率约为10% ~ 30%[5,6]。此外,由于缺乏直接触觉感受,外科医师对腹腔镜手术中的肿瘤精确定位及判断也存在一定的难度。因此,如何提高胃癌的早期诊断及精准完整的切除是胃癌诊疗过程中亟需解决的关键问题。近年来,吲哚菁绿（ICG）引导下的近红外成像技术逐渐应用于腹腔镜胃癌根治手术,但由于游离ICG存在缺乏肿瘤靶向特异性,不稳定,容易淬灭等缺陷,目前ICG并未广泛应用于临床[7,8]。
本研究通过双亲性聚合物二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺（DSPE-PEG-Mal）包覆ICG,形成水溶性荧光纳米粒子。并用能与整合素αvβ3特异性结合的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）多肽进行修饰,合成具有肿瘤特异性的靶向荧光纳米粒子DSPE-PEG-RGD@ICG,用以胃癌可视化成像及精准切除。本研究使用自主搭建的近红外荧光腹腔镜,在小鼠的胃癌皮下瘤模型中验证了该荧光纳米粒子的胃癌靶向性,为临床上客观指导外科医师早期及精准切除胃癌提供了一个新的策略。
材料与方法
一、实验材料
胃癌SGC7901细胞株购买于广州贝奥吉因生物技术有限公司。DSPE-PEG-Mal（Kw = 2000）购于上海炎怡生物科技有限公司。ICG购于上海融禾医药科技发展有限公司,RGD多肽购于上海吉尔生化有限公司。雌性BALB/c裸鼠（3 ~ 5周）购于北京维顿利华实验动物科技有限公司。
二、纳米材料的合成与表征
通过自组装方式将ICG包覆于纳米粒子中,通过迈克尔加成反应将RGD连接于表面,形成具有靶向功能的荧光纳米粒子,命名为DSPE-PEG-RGD@ICG。
具体合成过程如下：分别称取20 mg DSPE-PEG-Mal冻干粉和6.7 mg ICG,将两者混合溶于3 ml四氢呋喃,超声混合充分,再在超声探头的超声环境中,将混合溶液逐滴加入20 ml纯水,超声30 min,转移至3500 Da透析袋,透析24 h去除杂质,冻干保存。称取20 mg制备的冻干粉,溶于5 ml纯水,加入6 mg RGD多肽,搅拌反应4 h后,用1000 Da透析袋24 h,冻干保存备用,即得到具有靶向性的DSPE-PEG-RGD@ICG荧光纳米粒子。通过核磁谱图验证产物的合成。然后取适量的样品均匀分散在超纯水中,配制成ICG浓度为10 μg/ml的溶液,在室温条件下用紫外-可见光分光光度仪进行测定,记录500 ~ 900 nm范围内的光谱。
三、近红外荧光腹腔镜的搭建
采用785 nm光纤耦合激光器（MW-GX- 785/1500 mW,长春飞秒科技有限公司,中国）作为激发光光源,可见光光源使用医用LED冷光源（AGS100,梧州奥格森科技有限公司,中国）。内窥镜（11.0031a,Scholly Fiberoptic GMBH,德国）,直径10 mm,工作长度344 mm,0°视角。基于分光棱镜的双图像传感器集成工业相机（BV-C8820CL,Bluevision Ltd,日本）实现可见光与近红外荧光的同时成像。选用智能图像采集卡（microEnable-5-Marathon-ACL,Silicon Software,德国）,通过E-Vision CL线缆与集成相机的数据接口相连接,能高速传输到计算机。并自主开发了一款适用于该成像系统的软件,运行环境为Windows 10操作系统,将图像采集卡采集到的原始数据经过计算机软件处理后经显示器显示。
四、裸鼠胃癌皮下瘤模型的建立及荧光可视化成像
用3 ~ 5周龄雌性BALB/c裸鼠及胃癌细胞株SGC7901建立胃癌皮下瘤模型。将含有5×106个SGC7901细胞的磷酸盐缓冲液（PBS）溶液（0.2 ml）注射到裸鼠腋下,每隔1 d测量1次肿瘤大小,并计算体积：体积=长轴×短轴2/2。当肿瘤体积达到150 mm3左右时进行体内实验。选择9只荷瘤小鼠随机分成3组,每组各3只,1%戊巴比妥钠腹腔麻醉,分别尾静脉注射0.2 ml ICG、DSPE-PEG@ICG和DSPE-PEG-RGD@ICG溶液（每只小鼠ICG当量为2 mg/kg）。在特定的时间间隔（0.5、1、2、4、6 h）用自主搭建的荧光腹腔镜对小鼠进行荧光可视化成像,观察并记录不同药物在小鼠体内的分布情况。
五、近红外荧光成像指导下的精准手术
选择50只小鼠,皮下瘤模型建立9 d后（肿瘤直径为4 ~ 5 mm）进行实验。于术前4 h经尾静脉注射DSPE-PEG-RGD@ICG纳米粒子（剂量与前保持一致）。随后麻醉小鼠并在荧光腹腔镜引导下进行肿瘤切除。手术期间,通过实时白光/NIR荧光切换将肿瘤部位可见的荧光组织全部切除,记录肿瘤大小,并将切下的组织送病理检查。
结果
一、DSPE-PEG-RGD@ICG的合成及光谱
DSPE-PEG-RGD@ICG的合成方式如图1A所示,首先利用自组装方式将ICG包覆于DSPE-PEG-Mal中,然后利用迈克尔加成反应将RGD多肽连接于纳米粒子表面,动态光散射法测得产物粒径为（147.6±3.9）nm。DSPE-PEG-RGD核磁谱图如图1B所示,在7.43 ppm及6.47 ppm处出现新的吸收峰,这两处为RGD分子结构中苯环上氢的吸收峰,可判断RGD成功接在DSPE-PEG-Mal上,证实RGD成功修饰于纳米粒子表面。DSPE-PEG-RGD@ICG和ICG的吸收光谱如图1C所示,与游离ICG表现出类似的光学特性,表明DSPE-PEG-RGD@ICG未改变ICG的荧光性质。
二、近红外荧光腹腔镜的搭建及测试
三、荷瘤小鼠荧光可视化成像
通过构建裸鼠胃癌SGC7901皮下瘤模型,观察纳米粒子的体内生物分布情况。尾静脉注射不同荧光药物后,在多个时间点采集各组小鼠的荧光信号,见图3。3组静脉给药后,荧光信号迅速分布全身,主要集中于肝脏。随着时间的延续,3组荧光药物逐渐被肝脏代谢,荧光信号相应减弱。2 h后,游离ICG组仅在肝脏和肿瘤区域残留微弱的荧光信号,而DSPE-PEG@ICG和DSPE-PEG-RGD@ICG组在肿瘤部位仍有较高的荧光积累。4 h后,肉眼下,游离ICG组肿瘤部位基本观察不到绿色荧光,DSPE-PEG-RGD@ICG组在肿瘤部位的绿色荧光清晰可见,与非靶向纳米粒子DSPE-PEG@ICG组相比,能较好地显示出肿瘤轮廓。6 h后,切开皮肤,解剖肿瘤,在荧光腹腔镜辅助下,DSPE-PEG-RGD@ICG组肿瘤组织与正常组织可以较好地区分开来。与游离ICG相比,DSPE-PEG-RGD@ICG在体内具有更好的胃癌靶向能力。同时,最佳的手术操作时间是在静脉给药4 h后,此时,肿瘤部位荧光信号较强,其余部位如肝脏残留的荧光信号的影响较小。
四、荧光腹腔镜辅助下的胃癌小鼠模型的肿瘤切除
根据活体成像结果,经尾静脉注射DSPE-PEG-RGD@ICG 4 h后,利用荧光腹腔镜切除肿瘤,见图4A。构建50只小鼠胃癌皮下瘤模型,造模9 d后,皮下肿块平均直径为5.49 mm,见图4B。调整好参数后,将视野内可见的绿色荧光信号组织全部切除,同时送病理分析,证实是否为癌组织,见图4C。对于荧光下未显影的可疑肿块一并切除送检。1只小鼠皮下瘤模型病理下未见癌细胞,考虑为炎性组织,同时未能检测到荧光信号;4只小鼠肿瘤荧光下未显影（直径分别为3.1、3.2、3.5和4.0 mm）,考虑瘤块较小,荧光信号较弱,未能检测出来;45只小鼠皮下瘤荧光下显影,最终证实为癌组织,因此,纳米粒子对构建的胃癌模型检出率为91.8%。
讨论
既往研究表明,胃癌的治疗效果与肿瘤分期及完整切除密切相关。目前,腹腔镜胃癌根治术以其手术创伤小,术后恢复快等独特优势广泛应用于临床,但仍存在一些弊端。对于早期胃癌,肿瘤位于黏膜或者黏膜下层,常常需要进行术前定位或者术中联合胃镜来对肿瘤位置进行定位。术前胃镜下留置金属夹标记肿瘤位置存在夹子脱落导致定位失败的风险;术中胃镜则需要专门的内镜医师进行操作,并且延长手术时间[10]。对于进展期胃癌,由于缺乏直接触觉感受以及开放手术的直接肉眼观察,导致微小转移灶不易被发现和切除。近年来,荧光成像技术在临床中的应用越来越受到学者们的关注,试图通过荧光分子来实现肿瘤的特异性显像,达到精准诊疗的目的。其中,纳米载体是最常用的技术手段。
纳米载体的发展是为了应对药物输送的需要,这些方法解决了药物溶解度低、非特异性细胞毒性、次优药物动力学和药效动力学,以及较低的生物药效率的问题[11,12]。药物输送系统的设计是为了适应癌症的“主动靶向”和“被动靶向”。被动靶向是药物输送系统可以通过增强肿瘤脉管系统开窗进入肿瘤,并利用实体瘤中观察到的增强通透性和保留（EPR）的一种手段。由于肿瘤血管渗漏和肿瘤淋巴引流不良,EPR效应允许肿瘤选择性的摄取和保留纳米颗粒。此外,聚合物的多种功能为进一步改性提供可能,通过特异性配体修饰纳米颗粒的表面来实现主动靶向。整合素在多种肿瘤细胞表面和肿瘤血管内皮细胞表面高表达,而在正常细胞和血管内细胞中低表达,在癌细胞的增殖、迁移和侵袭中发挥重要作用[13]。有研究表明,整合素αvβ3在胃癌中广泛表达,并可能有助于胃癌亚型的常规分类[14]。本研究使用高表达整合素αvβ3的胃癌细胞SGC7901,建立胃癌皮下瘤模型。RGD多肽能够与整合素特异性结合,是目前研究最多的肿瘤精确诊断和治疗靶向分子之一。本研究选用RGD多肽修饰纳米粒子表面,通过纳米粒子的被动靶向,以及RGD多肽的主动靶向,实现对胃癌细胞的靶向结合。该载药系统并未改变ICG本身的光学特性。
既往研究表明,当ICG浓度大于80 μg/ml时,由于形成二聚体和多聚体,荧光强度反而随浓度的增加而下降[15]。本研究中该成像系统同样观察到了类似的现象,表明该系统搭建成功。活体成像结果表明,与游离ICG和非靶向纳米粒子DSPE-PEG@ICG相比,DSPE-PEG-RGD@ICG表现出更好的肿瘤靶向富集。静脉给药4 h后,在该荧光腹腔镜辅助下,肿瘤部位的荧光信号高于周围的正常组织。为进一步验证该纳米粒子对微小肿瘤的检出率,我们对50只荷瘤小鼠进行手术。结果表明该系统对胃癌皮下瘤检出率为91.8%,检出肿瘤的最小直径为4.9 mm。此外,该系统能够实时监测肿瘤切除情况,对于术中残留的少量荧光组织,切除后病理确诊为肿瘤组织。既往研究表明,对于进展期胃癌出现腹膜转移的患者,术前辅助检查如腹部超声、CT和PET等很难发现小于5 mm的肿瘤结节,往往需要腹腔镜检查或脱落细胞学检查[16]。本研究结果提示在该成像系统辅助下,DSPE-PEG-RGD@ICG在胃癌的精准诊断及完整切除方面具有很大的临床应用潜力。
综上所述,为了实现胃癌的可视化成像及精准切除,本研究构建了一种RGD多肽修饰的荧光纳米粒子DSPE-PEG-RGD@ICG。核磁谱图证实产物的成功合成,吸收光谱显示出与游离ICG相似的光学特性。借助自主搭建的荧光腹腔镜,证实了该纳米粒子在胃癌皮下瘤小鼠肿瘤部位的靶向富集,通过对荷瘤小鼠进行荧光成像辅助下的肿瘤切除,表明该系统对胃癌检出率为91.8%。目前,ICG近红外成像技术在胃癌诊疗中的应用尚处于探索阶段,我们的研究结果为胃癌的精准诊断及治疗提供了一个新的策略。