肺癌是人类健康的主要威胁之一,据估计2018年全球肺癌死亡人数达到180万[1]。肺癌的病理学类型常见非小细胞肺癌和小细胞肺癌。85%的肺癌为非小细胞肺癌,大多数患者在发现时已处于中晚期,失去了手术机会[2]。非小细胞肺癌发生发展关键驱动基因的深入研究,对患者和临床医师而言具有重要的意义。
代谢紊乱是许多肿瘤的特征。肿瘤对其代谢产物进行重新编程,以产生足够的能量维持生存。糖原主要储存在肌肉和肝脏中,在需要时作为能量供应。然而,非小细胞肺癌糖原代谢的改变及其分子机制仍然有待于进一步研究。糖原合成的关键酶之一糖原合成酶（GYS）包括2种亚型,即GYS1和GYS2。GYS1通常在肌肉、肺、心脏和肾脏中表达,而GYS2主要局限于肝脏[3]。研究表明,GYS1在缺氧条件下被迅速诱导,并与胶质母细胞瘤、乳腺癌和结肠癌细胞系中的糖原积累呈正相关[4]。GYS1的异常表达不仅降低了细胞糖酵解,而且增加了糖原反应性AMP激酶的激活,导致髓系白血病细胞的生长抑制[5]。然而,GYS1在非小细胞肺癌中的作用尚不明确,仍然有待于进一步研究。本研究旨在阐明GYS1在非小细胞肺癌细胞糖原代谢和增殖中的作用。
材料与方法
一、主要材料
正常人支气管上皮样细胞系HBE和人非小细胞肺癌细胞系NCI-H661、NCI-H1299购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。主要试剂包括青霉素-链霉素双抗（HyClone, 美国）,Opti-MEM培养基（Thermo Fisher Scientific, 美国）,Lipofectamine 3000 （Lip 3000,Invitrogen, 美国）,MTT（碧云天,中国）,DMEM培养基（Gibco, 美国）;TRIzol试剂（BIOO Scientific, 美国）,逆转录试剂（维诺赞, 中国）,定量PCR试剂（Takara, 中国）,RIPA裂解液（碧云天, 中国）,二喹啉甲酸（BCA）试剂盒（碧云天, 中国）;GYS1抗体（1:;1000, CST, 美国）;β-actin抗体（1:;2000, Santa Cruz Biotechnology, 美国）。
二、方法
1. 细胞培养
HBE正常人支气管上皮样细胞和NCI-H661、NCI-H1299人非小细胞肺癌细胞采用含胎牛血清（FBS）的DMEM培养基（1:;9）进行细胞培养,培养基中均含有100 μg/ml的链霉素和青霉素。取对数生长期的细胞用于实验。细胞培养箱条件设置为37℃、5% CO2。
2. 细胞转染
转染空载体质粒的NCI-H1299细胞为Vector组,转染GYS1重组质粒的NCI-H1299细胞为GYS1组;细胞转染的前1日,常规消化细胞并收集,离心洗涤1遍,制成单细胞悬液,计数后接种于24孔板（Corning, 美国）中,每孔细胞数1×105个;细胞转染当日,取Opti-MEM转染专用培养基稀释质粒,移液枪吹打;加入Lip 3000,应用移液枪轻轻吹打,等待20 min;取Lip 3000在Opti-MEM中稀释,移液枪轻轻吹打;取出前1日铺板的细胞,将混合液加入对应各孔中,“8”字摇晃混匀;37℃、5% CO2培养条件继续进行细胞培养,48 h后检测GYS1 mRNA的表达,72 h后检测GYS1蛋白的表达。
3. 实时荧光定量逆转录PCR（qRT-PCR）检测
应用TRIzol RNA提取试剂从GYS1过表达组和Vector组细胞中获取总RNA,然后逆转录、qRT-PCR检测mRNA表达水平。反应体系包括5 μl的SYBR premix（2倍稀释）、2 μl的cDNA模板、1 μl的混合引物（上下游引物提前混合,减少上样误差）、2 μl的DEPC水,震荡混匀。反应条件如下：95℃预变性30 s,95 ℃变性30 s,然后60℃退火20 s,40个循环,72℃延伸30 s。β-actin上游引物序列5’-GAAGCTAAGTCCTGCCCTCA-3’,下游引物序列5’-CAGTGAGGACCCTGGATGTG-3’,qRT-PCR产物长度为305 bp;GYS1上游引物序列5’-C AGCGCGGACCAACAATTTC-3’,下游引物序列5’-TCCTCCCGAACTTTTCCTTCA-3’,qRT-PCR产物长度为3474 bp。用2-△△Ct法分析基因的相对表达量,实验重复3次,结果取平均值。
4. 蛋白免疫印迹法检测
首先用预冷磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤Vector组和GYS1过表达组细胞1次,向6孔板中加入200 μl RIPA裂解液裂解细胞20 min,使裂解液充分接触细胞,每10 min摇匀1次;蛋白浓度测定应用BCA法;按比例加载样缓冲液金属浴95℃蛋白变性5 min;SDS-PAGE电泳分离蛋白质;0.22 μm PVDF膜转膜;5%牛奶封闭1 h;双蒸水清洗膜;加入一抗抗体（GYS1, 1:;1000;β-actin, 1:;2000）4℃过夜（最少16 h）;次日TBST洗膜液洗涤3遍,每次8 min;弃掉TBST洗膜液,加入二抗,室温孵育1 h;TBST洗膜液洗涤3次,每次8 min;电化学发光（ECL）法曝光成像;结果用Gelpro软件进行分析。
5. MTT检测
使用二甲基亚砜（DMSO）溶解MTT粉末配成终浓度为5 mg/ml的MTT溶液,-20℃避光保存,使用时室温溶解。取GYS1过表达组和对照（Vector）组细胞,制成单细胞悬液,96孔板铺板,每孔加入5×103个细胞,每组4个复孔;周围一圈加PBS;然后分别于检测时间点（24、48、72、96 h）,取出96孔板,每孔加入10 μl的MTT工作液,培养箱继续培养4 h;然后每孔加入100 μl的Formazan溶液溶解;在570 nm处测定吸光度（OD值）。
6. EdU增殖实验
按照说明书采用EdU法检测细胞增殖。细胞置于24孔板中培养24 h,加入100 μl EdU,用DAPI染色细胞核。荧光显微镜拍照并计数。实验重复3次。
7. 克隆形成实验
取Vector组和GYS1过表达组的细胞以1×103个/孔的细胞密度接种于6孔板;继续培养7 ~ 14 d;多聚甲醛固定后结晶紫染色;用自来水洗涤细胞,拍照并计数,实验重复3次,结果取平均值。
三、统计学处理
实验数据采用GraphPad Prism 8软件进行数据处理和制图,计量资料采用$\bar{x}±s$表示,2组间比较采用独立样本t检验,NCI-H661、NCI-H1299的GYS1 mRNA相对表达量与HBE细胞间GYS1 mRNA的比较先采用单因素方差分析,差异有统计学意义后采用Dunnet-t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
结果
一、GYS1在人非小细胞肺癌细胞中的表达
qRT-PCR检测了正常人支气管上皮样细胞系HBE和非小细胞肺癌细胞系NCI-H661、NCI-H1299中GYS1 mRNA相对表达量,结果显示3种细胞中GYSI mRNA相对表达量比较差异有统计学意义（F = 923.11,P < 0.001）,其中NCI-H661（Dunnet-t = 25.17,P < 0.001）、NCI-H1299（Dunnet-t = 43.73,P < 0.001）的GYS1 mRNA相对表达量均高于HBE细胞,见图1。
二、GYS1过表达对非小细胞肺癌细胞NCI- H1299增殖的影响
相比NCI-H661细胞,GYS1 mRNA在NCI-H1299细胞中的相对表达量较低,因此本研究选择过表达NCI-H1299细胞的GYS1,研究NCI-H1299细胞的变化。结果显示,与Vector组相比,NCI-H1299-GYS1过表达组细胞的GYS1 mRNA（t = 20.62,P < 0.001）和蛋白（t = 41.27,P < 0.001）相对表达量上调,见图2。成功构建NCI-H1299-GYS1过表达细胞模型后,MTT实验检测过表达GYS1对于NCI-H1299细胞增殖能力影响的结果显示,细胞培养72 h后,GYS1过表达组的OD值大于Vector组的OD值（t = 11.56,P < 0.001）,24 h和48 h的结果比较差异均无统计学意义（P均> 0.05）,见图3。进一步通过EdU增殖实验检测过表达GYS1对于NCI-H1299细胞增殖能力的影响,结果显示GYS1过表达组EdU阳性细胞数多于Vector组的EdU阳性细胞数（t = 18.59,P < 0.001）,见图4。以上结果提示GYS1过表达后,NCI-H1299细胞的增殖能力有所增加。
三、GYS1过表达促进了NCI-H1299细胞的克隆形成
讨论
本研究显示,GYS1在人非小细胞肺癌细胞的表达水平高于正常人支气管上皮样细胞,提示GYS1在非小细胞肺癌的发生发展中可能发挥重要的作用。后续细胞功能研究结果显示,GYS1促进了NCI-H1299细胞的增殖。Chen等[10]发现,GYS1过度表达促进了肾透明细胞癌的增殖,是肾透明细胞癌不良预后因素。
综上所述, GYS1在人非小细胞肺癌细胞的表达水平高于正常人支气管上皮样细胞,且GYS1促进了NCI-H1299细胞的增殖,揭示了GYS1可能是非小细胞肺癌的潜在药物靶点。