非小细胞肺癌（NSCLC）约占所有肺癌的80%,肺腺癌属于NSCLC。癌细胞迁移被认为肿瘤晚期的主要特征[1]。因此,对肺腺癌细胞侵袭机制的更好理解将有助于开发更多的治疗策略。外泌体的作用被认为是传递细胞间信号交流,肿瘤细胞分泌外泌体中携带大量致癌成分可以刺激肿瘤细胞迁移的发生发展[2]。研究表明,肿瘤外泌体可以通过改变肿瘤微环境、上皮细胞-间充质转化（EMT）和肿瘤微血管生成等多方面促进肿瘤进程[3,4]。近年来针对外泌体中长链非编码RNA（lncRNA）的作用越来越受到重视。LncRNA H19在不同癌种类型和细胞背景中发挥的作用也不尽相同[5,6]。到目前为止,lncRNA H19在肺癌细胞迁移和侵袭中的作用仍然不尽为人所知。一般认为,lncRNA在细胞中发挥“分子海绵”的作用,可大量吸附并抑制微RNA（miR）对靶基因的作用。前期研究显示,lncRNA H19可以通过吸附miR-7,并参与调控肿瘤微环境和血管异常化等,影响肿瘤转移前微环境形成[7,8]。肿瘤的转移和生长主要依赖新生血管的形成。然而,目前关于lncRNA H19参与肺癌侵袭迁移的机制鲜有报道。本研究探讨外泌体lncRNA H19与miR-7的关系以及其在肺腺癌迁移侵袭中的作用及机制,现报告如下。
材料与方法
一、实验试剂
主要有RPMI-1640培养基（美国Gibco）,胎牛血清（美国Gibco）,外泌体提取试剂盒（德国Qiagen）,Lipo3000转染试剂盒（美国Life）,TRIzol总RNA抽提试剂（美国Life）,逆转录试剂盒（日本TaKaRa）,实时荧光定量PCR（qRT-PCR）试剂盒（日本TaKaRa）,双荧光素酶报告基因试剂盒（美国Promega）,GM130抗体（美国Affnity）,CD63抗体（美国Affinity）,Kruppel样因子4（KLF4）抗体（美国Affinity）,血管内皮生长因子（VEGF）抗体（美国Affinity）,甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体（美国CST）,HRP-山羊抗兔二抗（博奥龙）。本研究所使用的引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。
二、细胞培养
人肺腺癌细胞系A549细胞（南部战区总医院肿瘤科张为民教授惠赠）用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基,于37 ℃、5%CO2、饱和湿度培养箱内培养,每48 h更换培养液1次。培养瓶中的细胞生长到80% ~ 95% 融合时进行细胞传代或收集细胞铺板培养。
三、外泌体分离及鉴定
收集广州市红十字会医院确诊肺腺癌并经影像学诊断已发生远处转移患者（转移组）或无远处转移患者（非转移组）以及正常人群（正常对照组）各30例外周血标本。本研究经广州市红十字会医院医学研究伦理委员会批准（批件号2019-146-01）,入组患者均已签署知情同意书。取患者外周血标本分离单核细胞获得血浆上清液,同时取培养A549细胞时收集的培养上清液,具体步骤按照试剂盒说明书执行。将提取外泌体按要求稀释至100 μg/100 μL。利用透射电镜对外泌体进行形态学鉴定,利用蛋白免疫印迹法分析外泌体的CD63和GM-130表达情况。
四、qRT-PCR
根据TRIzol试剂盒说明书从外泌体中提取总RNA。进行qRT-PCR测定以评估lncRNA H19 mRNA的表达,引物设计如下：lncRNA H19正向5’-ATCGGTGCCTCAGCGTTCGG-3’、反向5’-CTGTCCTCGCCGTCACACCG-3’,GAPDH正向5’-CAAGAGCACAAGAGGAAGAGAG-3’、反向5’-CTACATGGCAACTGTGAGGAG-3’。通过公式计算Ct值,具体为Ct = CtlncRNA H19-CtGAPDH,将lncRNA H19 mRNA表达水平标准化,每组设3个复孔,实验独立重复3次。
五、LncRNA H19 shRNA慢病毒的构建
将含有绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的慢病毒载体LV-008（永诺生物）用于表达靶向lncRNA H19（5’-CCAACATCAAAGACACCAT-3’）和干扰对照（5’-TGGTTTACATGTCGACTAA-3’）序列的短发夹RNA（shRNA）。用包装载体将LV-008-shH19质粒转染到人胚肾细胞HEK 293T细胞（南部战区总医院肿瘤科张为民教授惠赠）中。转染72 h收集含有感染慢病毒的上清液,100 000×g超速离心2 h浓缩慢病毒,并重悬于磷酸盐缓冲液中。将A549细胞接种在24孔板中,并在5 ~ 10 μg/mL聚凝胺存在下用慢病毒感染,后用2 μg/mL嘌呤霉素筛选lncRNA H19敲低细胞10 ~ 15 d。
六、双荧光素酶报告基因检测
利用在线数据库RNAhybrid （https：//bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid/）预测分析结合位点结果（图5A）,设计PCR引物,正向5’-CAGGGACATGGCAGGGGACACAGGACAG-3’,反向5’-CGCCAGGTCCGGTGGACGTGACAAGCAGG-3’。PCR产物经纯化回收后,连接到双荧光素酶报告基因pmirGLO质粒中,在野生型载体基础上,将结合位点GGCGGCGAG突变为CCGCCGCTC,并构建突变型载体。野生型和突变型分别命名为：pmirGLO-H19-WT和pmirGLO-H19-MUT,将各构建载体与miR-7共转染293T细胞。采用美国 Promega公司的双荧光素酶报告基因检测系统,依据实验说明进行操作,计算萤火虫荧光素酶值与海肾荧光值的比值反应荧光素酶活性。每组设3个复孔,实验独立重复3次。
七、划痕实验及Transwell实验
分离提取野生型或稳定干扰lncRNA H19的A549细胞外泌体,用其处理A549细胞12 h后,消化细胞,取对数生长期细胞,接种于6孔板,每孔约5×105个,待细胞达90%以上融合时,使用200 μL微量枪头均匀笔直划出划痕进行划痕实验。更换无血清培养液2 mL,置于37 ℃、5%CO2培养箱培养,于12、24 h倒置显微镜下拍照。将50 μL浓度为10%的Matrigel铺于Transwell小室底部,将外泌体处理后的A549细胞加入Transwell小室中,下室加入600 µL含10%胎牛血清的完全培养基,置于培养箱中培养24 h。弃Transwell小室培养基,磷酸盐缓冲液洗3次,使用冰甲醇固定15 min,0.1%结晶紫溶液染色20 min,取出Transwell小室,用棉签擦去上室内的细胞和基质胶,显微镜下观察Transwell小室底部下室侧附着的细胞。每组设3个复孔,实验独立重复3次。
八、蛋白免疫印迹法分析
用磷酸盐缓冲液洗涤后,将细胞重新悬浮并加入裂解液（50 mmol/L Tris缓冲液,100 mmol/LNaCl,1%NP-40裂解液和0.5%脱氧胆酸盐,1 mmol/L苯甲基磺酰基）4 ℃中裂解20 min。然后通过10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳,并转到聚二氟乙烯膜（德国Millipore）上。将膜在含有5%（质量/体积）脱脂奶粉的Tris-HCl缓冲盐溶液（TBST,含0.05%吐温20）封闭1 h,并与第一抗体（1∶1000）一起孵育2 h,然后洗涤3 h。用TBST洗涤3次,每次10 min,然后与二抗（1∶5000）孵育1 h。后用TBST洗涤3次,每次10 min,通过增强化学发光法（ECL, 瑞典Amersham Pharmacia Biotech）显色后化学发光成像系统成像,Band Scan图像分析软件进行积分光密度值分析。每组设3个复孔,实验独立重复3次。
九、统计学处理
使用SPSS 18.0进行分析,正态分布计量资料以$\bar{x}\pm s$表示,组间比较采用t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
结果
一、外泌体提取鉴定
二、转移组、非转移组肺腺癌患者和正常对照组患者外周血外泌体lncRNA H19 mRNA表达情况
因lncRNA H19表达差异在肿瘤发生发展已明确,且本文重点研究其在肿瘤转移过程中作用,故后续分析仅在转移组与未发生转移组之间进行比较,结果显示与非转移组肺腺癌患者相比,转移组肺腺癌患者外周血外泌体中lncRNA H19 mRNA表达增加（t = 2.776,P < 0.01）,提示lncRNA H19高表达可能与肺腺癌转移密切相关,见图2。
三、稳定敲低lncRNA H19的A549细胞构建
A549细胞中,与对照细胞相比,稳定敲低lncRNA H19细胞的外泌体中lncRNA H19 mRNA表达量减少约65%（t = 4.912,P < 0.01）,见图3。
四、稳定敲低lncRNA H19对A549细胞迁移和侵袭能力的影响
细胞划痕实验和Transwell实验显示敲低lncRNA H19的A549细胞迁移和侵袭的能力下降,见图4。
五、双荧光素酶报告基因验证lncRNA H19和miR-7相互结合
六、敲除外泌体H19导致下游信号蛋白的变化
讨论
转移是肺癌治疗领域的重要挑战,更好地了解肿瘤转移的分子机制可能会发现更有效的治疗策略。外泌体作为细胞交流的信号传递者,含有大量的lncRNA,在细胞中起到miR分子的“海绵吸附”作用,从而解除miR对靶基因的抑制作用[7,8,9]。本研究显示,临床中发生转移的肺腺癌患者血清中外泌体lncRNA H19 mRNA表达比未发生转移的肺腺癌患者明显升高,这表明外泌体源性lncRNA H19与肺癌发生转移有密切关系。进一步的研究表明,外泌体中包含lncRNA H19,通过竞争性内源RNA方式吸附miR-7的表达,从而解除miR-7对KLF4的翻译抑制,并激活KLF4/VEGF信号通路进而参与调控细胞迁移和侵袭。
外泌体被认为是造成原发性肿瘤微环境改变的重要通讯介质[10,11,12,13]。外泌体是粒径为30 ~ 150 nm的小囊泡。这些小囊泡通过胞吐方式被释放到细胞外环境中并造成受体细胞相关表型改变[14,15]。因此,外泌体作为细胞间通讯的有效介质,在肿瘤发生中具有关键作用。多项研究显示肿瘤细胞分泌外泌体增多,且易于从血液中分离。细胞外泌体是近年来发现的一类细胞间信号传递的关键媒介,这种由细胞主动分泌的微小囊泡,可将细胞内大量信息物质打包,由一个细胞传递至另一个细胞,从而对靶细胞的性质进行跨细胞调控[16]。肿瘤细胞来源的外泌体通过转运具有生物功能的相关分子如蛋白质、miR和lncRNA等来调节靶细胞[17,18,19,20]。本研究中,稳定敲低表达外泌体lncRNA H19的A549细胞后,其迁移和侵袭能力下降。
综上所述,肺癌细胞分泌的外泌体中含有lncRNA H19,它通过竞争性吸附miR-7,从而解除miR-7对KLF4的翻译抑制,并激活KLF4/VEGF信号通路进而参与调控细胞迁移和侵袭,敲低外泌体lncRNA H19可抑制肺腺癌细胞的迁移和侵袭。lncRNA H19可能在肺腺癌发展中起重要作用,可考虑作为转移性肺腺癌诊断和治疗研究的潜在靶点。值得注意的是,本研究仅涉及单一肿瘤细胞,其他不同肺癌细胞尤其是不同侵袭能力的肺癌细胞中有待进一步加以证实,且外泌体lncRNA H19参与肺癌侵袭转移是否存在其他作用机制仍需后续实验加以验证。