甲状腺癌是一种常见的内分泌腺的恶性肿瘤,其发病率在世界范围内迅速增加,自1973年以来,甲状腺癌的年发病率上升了近50%。越来越多的研究已经评估了免疫组织化学标志物在甲状腺癌中的诊断价值。虽然依靠一些免疫标志物有望区分甲状腺良恶性病变,但缺乏可靠的鉴别诊断[1]。因此需要寻找新的免疫化学标志物或组合用于甲状腺良恶性病变的诊断。本研究采用免疫组织化学SP法和qPCR方法联合测定沉默信息调节因子1（Sirt1）、信号转导与转录激活因子3（Stat3） 在甲状腺癌中的表达,并分析其在甲状腺癌中的诊断价值。本研究同时测定纤维连接蛋白1（FN1）和E-钙黏蛋白（E-cadherin）的表达,以期为该类疾病的临床诊治提供一定参考依据。
对象和方法
一、研究对象
2017年1月至2018年10月于福建医科大学附属漳州市医院就诊的甲状腺相关疾病的标本142例,其中甲状腺乳头状癌（PTC）83例（PTC组）,甲状腺腺瘤28例（甲状腺腺瘤组）,结节性甲状腺肿21例（结节性甲状腺肿组）,正常甲状腺组织10例（正常甲状腺组织组）。PTC组中男28例、女55例;年龄小于45岁36例,45岁以上47例;按有无淋巴结转移分为有淋巴结转移组（31例）和无淋巴结转移组（52例）。上述病例均由本院病理科2位副主任医师以上职称的专家诊断。入选标准：①术前均未进行放射治疗、化学治疗和内分泌治疗;②满足WHO关于PTC的诊断标准则排除在外,如出血、感染、坏死严重者。通过手术切除获取的、用于研究的甲状腺组织符合医院伦理委员会要求（批件号：2021LMB249）。
二、主要试剂及仪器
兔抗人Sirt1单克隆抗体、兔抗人Stat3单克隆抗体、兔抗人FN1单克隆抗体、兔抗人E-cadherin单克隆抗体购自Abcam公司;SP免疫组织化学试剂盒、DAB染色试剂盒均购自北京中山金桥生物技术有限公司;RNA提取试剂盒购自北京Qiagen公司;逆转录试剂盒购自常州百代生物科技有限公司;荧光定量PCR试剂盒购自宝日医生物技术（北京）有限公司。
光学显微镜、摊片机、切片机、组织包埋机购自德国Leica;生物安全柜购自上海苏净实业有限公司;低温离心机购自德国Eppendorf Centrifuge;掌心离心机购自美国AndyBio;PCR荧光定量仪购自罗氏诊断产品（上海）有限公司。
三、实验方法
采用免疫组织化学SP法、qPCR法分别检测Sirt1、Stat3、FN1和E-cadherin蛋白及mRNA在PTC、甲状腺腺瘤、结节性甲状腺肿及正常甲状腺组织中的表达,具体操作步骤按照试剂说明书进行。免疫组织化学法结果判定：判定结果采用双盲法,由本院病理科两位副主任职称以上的医师独立读片。染色结果判读标准采用半定量分析法,以0∼4分来判定阳性细胞的百分比,阳性细胞百分比≤5%,0分;阳性细胞百分比6%∼25%,1分;阳性细胞百分比26%∼50%,2分;阳性细胞百分比50%∼75%,3分;阳性细胞百分比> 75%,4分。染色强度无色计为0分,淡黄色计为1分,棕黄色计为2分,棕褐色计为3分。2个指标的乘积作为最终评分：0∼1分,阴性;2∼4分,弱阳性;5∼8分,中阳性;> 9分,强阳性。中阳性和强阳性记为（+）,阴性和弱阳性记为（-）。
四、统计学处理
所有数据采用SPSS 22.0软件包处理,定性资料比较采用皮尔逊χ2检验,当T < 5时,采用连续性修正X2检验。对正态分布连续变量以$\bar{x} \pm s$表示,比较采用Student t检验,对非参数分布连续变量进行Mann–Whitney U检验,检验水准为α= 0.05,P < 0.05为统计学差异有意义,并计算灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和诊断准确率。
结果
一、镜下所见
Sirt1阳性细胞在细胞核中表达,大多呈中~强度阳性。Stat3阳性细胞主要表达于细胞膜和细胞质中,多数呈中~强度阳性。FN1阳性细胞主要集中在细胞间隙和细胞膜上,大部分呈中~强度阳性。而E-cadherin阳性细胞主要定位在细胞膜上,大多数呈阴性或弱阳性,见图1~4。
二、不同病理类型甲状腺组织中Sirt1、Stat3、FN1、E-cadherin的表达
三、Sirt1、Stat3、FN1和E-cadherin在PTC组中的表达与临床病理参数的关系
免疫组化SP法及qPCR法结果均表明,在PTC组中,Sirt1和Stat3在淋巴结转移组的表达明显高于无淋巴结转移组,差异均有统计学意义（P均< 0.05）。而不同性别、年龄患者间Sirt1和Stat3的表达差异均无统计学意义（P均> 0.05）,见表1~2。
表1 Sirt1、Stat3、FN1以及E-cadherin mRNA的表达与PTC临床病理参数的关系（x±s） |
| 临床病理参数 | 例数 | Sirt1 mRNA | Stat3 mRNA | FN1 mRNA | E-cadherin mRNA | |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 年龄 | ≥ 45岁 | 47 | 5.71±0.39 | 4.19±0.48 | 5.15±0.70 | 0.32±0.16 |
| < 45岁 | 36 | 5.17±0.73 | 4.53±0.60 | 5.56±0.58 | 0.52±0.28 | |
| 性别 | 男 | 28 | 5.19±0.64 | 4.60±0.57 | 5.45±0.67 | 0.38±0.18 |
| 女 | 55 | 5.63±0.59 | 4.13±0.45 | 5.26±0.68 | 0.46±0.30 | |
| 淋巴结转移 | 有 | 31 | 6.16±0.52a | 4.81±0.41a | 5.10±0.68 | 0.49±0.28 |
| 无 | 52 | 5.04±0.50 | 3.89±0.14 | 5.62±0.56 | 0.35±0.18 |
注：与对照组相比,aP < 0.05。 |
表2 Sirt1、Stat3蛋白与PTC临床病理参数的关系[例（%）] |
| 临床病理参数 | 例数 | Sirt1蛋白阳性率 | X2值 | P值 | Stat3蛋白阳性率 | X2值 | P值 | |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 年龄 | ≥ 45岁 | 47 | 41（87.23） | 0.22a | 0.881 | 34（72.34） | 2.276a | 0.131 |
| < 45岁 | 36 | 31（86.11） | 31（86.11） | |||||
| 性别 | 男 | 28 | 25（89.29） | 0.013b | 0.908 | 24（85.71） | 0.784b | 0.376 |
| 女 | 55 | 51（92.73） | 41（74.55） | |||||
| 淋巴结转移 | 有 | 31 | 31（100.00） | 0.042 | 29（93.55） | 5.406b | 0.020 | |
| 无 | 52 | 45（86.54） | 36（69.23） |
注：a为皮尔逊X2检验;b为连续性修正X2。 |
表3 FN1、E-cadherin蛋白与PTC临床病理参数的关系[例（%）] |
| 临床病理参数 | 例数 | FN1 蛋白阳性率 | X2值 | P值 | E-cadherin 蛋白阳性率 | X2值 | P值 | |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 年龄 | ≥ 45岁 | 47 | 38（80.85） | 0.402a | 0.526 | 6（12.77） | 1.300a | 0.254 |
| < 45岁 | 36 | 31（86.11） | 8（22.22） | |||||
| 性别 | 男 | 28 | 24（85.71） | 0.019b | 0.890 | 4（14.29） | 0.019b | 0.890 |
| 女 | 55 | 45（81.82） | 10（18.18） | |||||
| 淋巴结转移 | 有 | 31 | 25（80.65） | 0.218a | 0.640 | 7（22.58） | 1.152a | 0.283 |
| 无 | 52 | 44（84.62） | 7（13.46） |
注：a为皮尔逊X2检验;b为连续性修正X2。 |
四、单独或联合检测Sirt1、Stat3、FN1和E-cadherin对PTC的诊断价值
表4 Sirt1、Stat3、FN1以及E-cadherin单独检测对PTC的诊断价值 单位：% |
| 免疫标志物 | 灵敏度 | 特异度 | 阳性预测值 | 阴性预测值 | 诊断准确率 |
|---|---|---|---|---|---|
| Sirt1 | 86.7 | 72.9 | 81.8 | 79.6 | 59.6 |
| Stat3 | 78.3 | 62.7 | 74.7 | 67.3 | 41.0 |
| FN1 | 83.1 | 67.8 | 78.4 | 74.1 | 50.9 |
| E-cadherin | 16.9 | 57.6 | 35.9 | 33.0 | -25.5 |
表5 Sirt1、Stat3、FN1以及E-cadherin联合检测对PTC的诊断价值 单位：% |
| 免疫标志物组合 | 灵敏度 | 特异度 | 阳性预测值 | 阴性预测值 | 诊断准确率 |
|---|---|---|---|---|---|
| Sirt1+Stat3 | 77.1 | 94.9 | 95.5 | 74.7 | 72.0 |
| Sirt1+FN1 | 80.7 | 91.5 | 93.1 | 77.1 | 72.2 |
| Sirt1+E-cadherin | 15.7 | 83.1 | 56.5 | 41.2 | -1.3 |
| Stat3+FN1 | 75.9 | 91.5 | 92.6 | 73.0 | 67.4 |
| Stat3+E-cadherin | 14.5 | 88.1 | 63.2 | 42.3 | 2.6 |
| FN1+E-cadherin | 16.9 | 86.4 | 63.6 | 42.5 | 3.3 |
| Sirt1+Stat3+FN1 | 75.9 | 98.3 | 98.4 | 74.4 | 74.2 |
| Sirt1+Stat3+E-cadherin | 14.5 | 96.6 | 85.7 | 44.5 | 11.1 |
| Sirt1+FN1+E-cadherin | 15.7 | 94.9 | 81.3 | 44.4 | 10.6 |
| Stat3+FN1+E-cadherin | 14.5 | 96.6 | 85.7 | 44.5 | 11.1 |
| Sirt1+Stat3+FN1+E-cadherin | 12.0 | 98.3 | 90.9 | 44.3 | 10.4 |
讨论
随着敏感成像研究和细针穿刺活检的广泛应用,越来越多的甲状腺癌可早期被发现,这也间接导致甲状腺癌发病率的增加,特别是小于2 cm的甲状腺癌发病率的增加。尽管其可以通过手术切除治愈,但死亡人数也有所增加。目前,甲状腺癌主要通过手术和放射性碘消融治疗,但仅对未转移的原发肿瘤有效。转移性和复发性肿瘤大多是无法治愈的[2]。因此,早期发现甲状腺癌,并早期进行诊断治疗尤为重要。
Sirt1是一种依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的去乙酰化酶,在大多数哺乳动物器官中广泛表达。Sirt1主要通过使多种转录因子去乙酰化,如HSF1、NF-κB、PGC-1α、FOXO家族等,参与氧化应激、细胞凋亡等病理生理过程,目前已被广泛研究。在哺乳动物中,有确凿的证据表明Sirt1可以防止由高脂肪饮食引起的代谢损伤以及一些与衰老有关的疾病。由于这些有益的影响,Sirt1激活剂已经在应用治疗糖尿病的临床试验中,并可能在未来应用于其他与年龄相关的疾病。早期的体外研究报道揭示了Sirt1对肿瘤抑制蛋白p53的去乙酰化和抑制作用,再加上Sirt1在多种肿瘤类型中的表达增加,提示Sirt1具有致癌作用。然而,与预期相反的是也有文献报道支持Sirt1作为一种抑癌基因,能抑制肿瘤细胞生长、侵袭,并促进其凋亡。为了明确Sirt1在PTC中的作用,本研究通过免疫组化SP法和qPCR方法,测定了其在PTC中的表达。实验发现, Sirt1蛋白和mRNA在PTC患者中的表达明显高于其在正常甲状腺组织患者中的表达,且高于甲状腺腺瘤和结节性甲状腺肿患者中的表达,差异均有统计学意义;而Sirt1蛋白和mRNA在甲状腺腺瘤和甲状腺腺瘤中的表达与正常甲状腺组织相比无明显差异。流行病学资料表明,PTC可发生于任何年龄,但好发于年轻女性。本研究结合临床病理参数统计后发现,Sirt1的表达与PTC患者的年龄、性别无明显相关,但淋巴结转移组表达高于无淋巴结转移组,与吴文艺等[3]和董玲玲等[4]研究报道基本一致。
Stat3既是一种细胞质信号分子,也是一种核转录因子,属于Stats基因转录因子家族。Stat3的激活依赖于特异酪氨酸残基的磷酸化,激活的Stat3转移到细胞核内,并与靶基因序列一致的启动子结合,从而激活转录过程。越来越多的研究报道了Stat蛋白,特别是Stat3蛋白在肿瘤细胞株以及人体肿瘤标本中持续异常激活,如胰腺癌、卵巢癌、头颈部肿瘤以及其他癌症。本研究结果显示,PTC组中Stat3蛋白和mRNA的表达明显高于正常甲状腺组织组,并高于甲状腺腺瘤组和结节性甲状腺肿组中的表达;而甲状腺腺瘤和结节性甲状腺肿Stat3蛋白和mRNA的表达与正常甲状腺组织相比无明显差异。同时还观察到Stat3的表达与PTC患者淋巴结转移密切相关,而与患者的年龄、性别无关。此结果表明了Stat3在甲状腺肿瘤的发生发展以及转移中起着重要的作用。
汪永旭等（2013年）报道,Stat3的表达与PTC的年龄呈正相关,Stat3蛋白的阳性率在大于45岁组明显高于小于45岁组。同样,Stat3的表达与PTC淋巴结转移的关系也存在争议。张晨蕾等（2016年）研究报道PTC中Stat3蛋白的阳性率与淋巴结转移无明显相关。但汪永旭等（2013年）认为PTC中Stat3蛋白的阳性率与淋巴结转移明显相关,淋巴结转移组Stat3蛋白的阳性率明显高于无淋巴结转移组,表明Stat3的表达与PTC的临床病理参数关系密切,在肿瘤的诊断和预后中扮演着重要的角色。此外,本研究免疫组化中Stat3蛋白的阳性率为78.31%,低于张晨蕾等[5]的报道,可能与本研究阳性判断标准较为严格以及标本数量相对较多有关。
在生长发育过程中,上皮细胞的特征发生了巨大的变化,并增加了其运动能力,以便迁移、分支或形成管状。这种细胞极性和分化状态的功能和表型变化过程称为上皮间质转化（EMT）[6]。目前,越来越多的研究肯定了EMT的激活在肿瘤发展转移中的作用,主要基于主要的间充质标志物,如波形蛋白、FN1、N-钙黏素和成纤维细胞特异性蛋白-1可以在肿瘤细胞中检测到[7]。FN1和E-cadherin是两种主要的间充质标志物,在肿瘤的发生发展中扮演重要的角色。本研究结果显示,一方面正常甲状腺组织中FN1的表达较低,PTC中FN1的表达异常升高,明显高于甲状腺腺瘤和结节性甲状腺肿中FN1的表达,而FN1在甲状腺腺瘤和结节性甲状腺肿中的表达与正常甲状腺组织无明显差异。另一方面,E-cadherin在PTC中的表达与FN1正好相反,其在PTC中的表达明显低于甲状腺腺瘤、结节性甲状腺肿和正常甲状腺组织中E-cadherin的表达,而在甲状腺腺瘤和结节性甲状腺肿中的表达与正常甲状腺组织无明显差异,与Sponziello等[8]报道一致。在进一步观察FN1和E-cadherin的表达与PTC患者临床病理参数的关系发现,FN1和E-cadherin的表达与患者年龄、性别及淋巴结转移均无关。
Ryu等（1999年）发现在甲状腺癌中,淋巴结转移组中FN1的表达要少于无淋巴结转移组,主要表现为FN1在细胞外基质的缺失。Wei等（2005年）报道了在甲状腺癌中,小干扰RNA介导的PTEN的下调导致FN1的表达下降,从而导致细胞的黏附性降低,间接说明了甲状腺癌中高表达的FN1可以增强肿瘤细胞之间的黏附,从而减少肿瘤的转移。而蒋炜杰等[9]认为FN1的表达与甲状腺癌患者有无淋巴结转移呈正相关。而本研究结果显示在PTC中,FN1的表达与有无淋巴结转移无明显相关。张宏伟等（2016年）探究了甲状腺癌中E-cadherin的表达与淋巴结转移的关系,发现了在无淋巴结转移组,E-cadherin表达明显增加,孙琳（2014年）的研究也肯定了这结果。然而,胥博闻[10]研究发现甲状腺癌中E-cadherin的表达与淋巴结转移无明显相关,与本研究结果一致。因此,FN1和E-cadherin的表达可能在一定程度上参与了甲状腺癌发生发展的过程,可以作为PTC鉴别诊断的一个参考指标。
同时,在评价免疫标志物的诊断价值时发现,联合检测两种或多种免疫标志物时,其特异度、灵敏度以及诊断准确率均明显提高。由此可见,联合检测Sirt1、Stat3、FN1和E-cadherin在PTC中的表达对其诊断和鉴别诊断的判断有一定的参考意义。同时,通过研究上述4种基因与PTC的临床生物学行为的关系,也可提高其术前诊断率,进而进一步优化治疗方案。
由于各种原因的限制,甲状腺滤泡状癌、甲状腺髓样癌以及甲状腺未分化癌的标本较难收集,本研究仅收集了PTC标本作为研究对象,并且本研究未能深入研究Sirt1 / Stat3通路在PTC中的作用,以后将进一步扩大标本类型,进行更深入的探讨研究。