JOURNAL OF NEW MEDICINE >

2023 , Vol. 54 >Issue 2: 120 - 126

DOI: https://doi.org/10.3969/j.issn.0253-9802.2023.02.007

Original Research

Effect of IL-18BP on anxiety-like behavior in traumatic brain injury rats and its mechanism

  • Li Yan ,
  • Qi Manman ,
  • Jiao Baojie ,
  • Li Chunlei ,
  • Wang Chunlei ,
  • Chang Yulin
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  • △Department of Anesthesiology， Cangzhou Central Hospital， Cangzhou 061000， China
Chang Yulin， E-mail:

Received date: 2022-07-07

  Online published: 2023-03-03

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Abstract

Objective To evaluate the effect of IL-18 binding protein （IL-18BP） on anxiety-like behavior after traumatic brain injury （TBI） in rats and its related mechanism. Methods Seventy-two adult male SD rats were divided into 3 groups（all n = 24） using the random number table method： sham-operated （Sham） group， TBI group， traumatic brain injury plus IL-18BP （TBI+IL-18BP） group. The skull was exposed and skin incisions were then closed without TBI in sham group. The rodent model of TBI was established using the weight-drop method. In TBI+IL-18BP group， IL-18BP was administered by tail vein at a dose of 1.5 mg/kg immediately after TBI. The changes in anxiety-like behaviors in rats were measured by the open field and elevated plus maze tests. The number of neuron and activated astrocytes as well as the percentage of NLRP3 and IL-18 positive astrocytes in amygdala region were detected by immunofluorescence assay. The concentration of IL-18 in serum and cerebrospinal fluid was detected by ELISA. The expression levels of NLRP3， activated Caspase-1（cl-Caspase-1）， N-GSDMD in the amygdala were detected using western blot. Results At 30 d post-TBI， compared with the Sham group， rats in the TBI and TBI+IL-18BP groups had statistically less entry times and shorter time spending in the central square of the open field， significantly lower percentage of open arm entries and percentage of open arm time in the elevated plus maze tests， significantly increased concentration of IL-18 in the serum and cerebrospinal fluid， up-regulated activation of astrocytes in the amygdala， higher percentage of NLRP3 and IL-18 positive astrocytes， as well as up-regulated expression levels of the pyroptosis-related proteins including NLRP3， cl-Caspase-1 and N-GSDMD （all P < 0.05）. While compared with the TBI group， rats in the TBI+IL-18BP group had statistically more entry times and longer time spending in the central square of the open field， significantly higher percentage of open arm entries and percentage of open arm time in the elevated plus maze tests， significantly lower concentration of IL-18 in the serum and cerebrospinal fluid， down-regulated activation of astrocytes in the amygdala， lower percentage of NLRP3 and IL-18 positive astrocytes， and down-regulated expression levels of the pyroptosis-related proteins （all P < 0.05）. Conclusions IL-18BP can alleviate TBI-induced anxiety-like behaviors to certain extent in rats， probably associated with the inhibition of pyroptosis associated with NLRP3 inflammasome in astrocytes.

Key words： IL-18BP; Traumatic brain injury; Anxiety; Pyroptosis

Cite this article

Li Yan , Qi Manman , Jiao Baojie , Li Chunlei , Wang Chunlei , Chang Yulin . Effect of IL-18BP on anxiety-like behavior in traumatic brain injury rats and its mechanism[J]. JOURNAL OF NEW MEDICINE, 2023 , 54(2) : 120 -126 . DOI: 10.3969/j.issn.0253-9802.2023.02.007

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文章视频简介
血脑屏障受损、灌注不足、炎症因子释放等原因均会造成创伤性颅脑损伤（TBI）患者预后不佳，存活患者相关神经功能的恢复是目前的治疗难题[1]。研究显示TBI或不全脑缺血再灌注损伤后的大鼠会出现长期且严重的情绪障碍如焦虑、抑郁等[2-3]。IL-18是IFN-γ诱导因子，是一种多效性辅助性T细胞1型促炎因子[4]。大脑对IL-18信号尤为敏感，因为中枢神经系统中多种类型的神经细胞表达IL-18的受体，参与调节TBI后的神经细胞焦亡[5-6]。IL-18结合蛋白（IL-18BP）是IL-18的天然抑制剂，在正常情况下，足够的IL-18BP使游离IL-18保持低水平状态[7]。但在某些炎症性疾病中，IL-18过量产生和释放使IL-18与IL-18BP之间的平衡被破坏，导致病理性炎症的发生[8]。但是IL-18BP对TBI后神经功能恢复的影响以及相关机制至今尚无定论。因此，本研究拟探究IL-18BP在TBI大鼠焦虑样行为中的作用及机制，揭示TBI对神经系统损伤的潜在机制和治疗靶点，为临床治疗提供科学依据。

材料与方法

一、材料

1.实验动物

本研究实验动物为7~8周龄、体重250~300 g的清洁级雄性SD大鼠72只（辽宁长生生物技术股份有限公司）。本实验均按照本院动物护理与使用委员会的标准进行。本研究经本院动物评审委员会批准[伦理批准文号：2021-072-02（z）]。

2.主要试剂

神经元核抗原抗体（NeuN）鼠抗单克隆抗体（英国Abcam公司）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）鼠抗单克隆抗体（上海碧云天生物技术有限公司）、NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）兔抗多克隆抗体（北京索莱宝科技有限公司）、IL-18兔抗多克隆抗体（上海碧云天生物技术有限公司）、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（cl-Caspase-1）兔抗多克隆抗体（英国Abcam公司）、消皮素D（GSDMD）兔抗多克隆抗体（美国Cell Singnaling公司）、大鼠IL-18 ELISA试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）。

二、方法

1.动物分组及干预方法

将72只大鼠按照随机数字表法分为3组各24只：假手术组（Sham组）、TBI组、TBI+IL-18BP组。TBI+IL-18BP组大鼠在TBI后即刻经鼠尾静脉注射IL-18BP 1.5 mg/kg（溶于双蒸水，批号：HY-P7211，美国MCE生物科技公司）。

2. TBI模型建立

将大鼠麻醉后固定于装有加温装置的操作台上，将大鼠头固定于脑立体定位仪（上海玉研科学仪器有限公司）上，头颅皮肤消毒后，沿正中切开皮肤，剥离骨膜，暴露右顶骨。用牙科钻在前囟点（双眼连线与双耳连线前1/3）后3.5 mm，中线右侧2.5 mm处钻一直径为6 mm的骨窗，用20 g砝码于25 cm高度坠落致大鼠TBI。TBI组与TBI+IL-18BP组按上述操作，Sham组只开骨窗，不予砝码打击即进行缝合。

3.行为学检测

3.1 旷场实验
每组抽取12只大鼠于模型制备后第30日进行旷场实验。将黑色正方形敞箱（60 cm× 60 cm× 40 cm）分割成16个相等的方格。实验时将大鼠从敞箱的同一位置轻柔地放于箱内，适应1 min。记录大鼠5 min内的运动距离、中央区进入次数及中央区滞留时间。
高架十字迷宫检测大鼠在旷场实验结束后休息2 h再进行高架十字迷宫检测，十字迷宫由2个闭合臂（50 cm×10 cm×40 cm）和2个同样大小的开放臂组成，彼此夹角90°。记录大鼠被放入高架十字迷宫5 min内的运动轨迹。统计每只大鼠在迷宫中运动总距离、开放臂进入次数百分比以及滞留时间百分比。开放臂进入次数百分比=开放臂进入次数/（开放臂进入次数+闭合臂进入次数）；开放臂滞留时间百分比=开放臂滞留时间/（开放臂滞留时间+闭合臂滞留时间）。

4. ELISA检测

模型制备后第30日，检测大鼠血清和脑脊液中IL-18浓度，参照IL-18 ELISA试剂盒（批号：EK0592，武汉博士德生物工程有限公司）说明书进行操作。

5.免疫荧光检测

每组抽取6只大鼠，于取血结束后取其脑组织，固定48 h后制作石蜡切片。石蜡切片经过脱蜡、水化、抗原修复后封闭。在切片上滴加一抗NeuN（1∶200）、GFAP（1∶200）、NLRP3（1∶200）、IL-18（1∶200），切片至于4℃黑盒内过夜。次日，切片用磷酸盐缓冲液洗涤。滴加Cy3标记山羊抗鼠IgG （1∶500）和FITC标记山羊抗兔IgG （1∶500）并于37℃孵育1 h。滴加一滴4,6-二脒基-2-苯基吲哚染液5 min，双盲法荧光显微镜下观察，每张切片观察5个视野，计算GFAP和NeuN的阳性细胞数，NLRP3/GFAP、IL-18/GFAP双阳性细胞百分比即星形胶质细胞焦亡的情况。

6.蛋白免疫印迹法检测

每组抽取6只大鼠，于取血结束后取下其杏仁核区。用蛋白印迹及IP细胞裂解液提取杏仁核区的细胞总蛋白，用BCA法测蛋白浓度。每泳道上样30 μg蛋白，分别用12%（cl-Caspase-1、N-GSDMD）和8%（NLRP3）的SDS-聚丙烯酰胺凝胶恒流电泳，恒压转膜至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。加入NLRP3（1∶1000）、cl-Caspase-1（1∶1000）、N-GSDMD（1∶1000）一抗4℃孵育PVDF膜过夜。次日，TBST洗膜后加入山羊抗兔IgG二抗（1∶1000）25℃孵育1 h。ECL发光。应用Image-Pro Plus 6.0分析各条带的灰度值，以GAPDH作为内参。目的蛋白与内参的灰度比值为目标蛋白的相对表达量。

三、统计学处理

采用SPSS 20.0和GraphPad Prism 9.0处理数据，实验数据均符合正态分布，以 表示。组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

结果

一、IL-18BP对TBI大鼠焦虑样行为的影响

旷场实验显示，与Sham组相比，TBI组、TBI+IL-18BP组大鼠中央区进入次数与中央区活动时间均减少（P均< 0. 05）。与TBI组相比，TBI+IL-18BP组大鼠中央区进入次数与中央区活动时间均增加（P均< 0.05）。见表1。
表1 大鼠术后第30日旷场实验结果$(\bar{x} \pm s)$
组 别 只数 运动距离/m 中央区进入次数/次 中央区活动时间/s
Sham组 12 12.22±0.73 51.08±6.76 56.33±4.45
TBI组 12 12.29±0.80 24.08±3.63a 24.33±3.55a
TBI+IL-18BP组 12 12.16±0.67 36.83±4.37b 38.25±3.28b
F值 0.017 84.250 174.700
P值 0.983 <0.001 <0.001

注：与Sham组相比，aP < 0.05； 与TBI组相比，bP < 0.05。

高架十字迷宫实验显示，与Sham组比较，TBI组、TBI+IL-18BP组大鼠开放臂进入次数百分比与开放臂运动时间百分比均减少（P均< 0. 05）。与TBI组相比，TBI+IL-18BP组大鼠开放臂进入次数百分比与时间百分比均增加（P均< 0. 05）。见表2。
表2 大鼠术后第30日高架十字迷宫结果$(\bar{x} \pm s)$
组 别 只数 运动距离/m 开放臂进入次数百分比/% 开放臂运动时间百分比/%
Sham组 12 28.95±3.05 54.83±3.54 32.33±2.77
TBI组 12 29.61±3.30 20.83±4.24a 11.25±2.14a
TBI+IL-18BP组 12 30.24±2.56 39.08±3.70b 19.67±2.71b
F值 0.559 235.800 206.900
P值 0.577 <0.001 <0.001

注：与Sham组相比，aP < 0.05； 与TBI组相比，bP < 0.05。

二、大鼠杏仁核区神经元、星形胶质细胞数量变化

3组大鼠TBI后杏仁核区神经元的数量无明显差异（F = 0.230，P = 0.950），但星形胶质细胞的激活（GFAP阳性）差异有统计学意义（F = 285.000，P < 0.001）。与Sham组相比，TBI组、TBI+IL-18BP组大鼠星形胶质细胞的激活数量增加；与TBI 组相比，TBI+IL-18BP组大鼠的星形胶质细胞激活数量减少（P均< 0. 05）。见图1~2。
图1 大鼠术后第30日杏仁核区神经元与活化的星形胶质细胞（免疫荧光染色）

注：杏仁核区神经元用NeuN表示；活化的星形胶质细胞用GFAP表示；每组n = 6，标尺= 50 μm。

图2 大鼠术后第30日杏仁核区神经元与星形胶质细胞数目统计图

注：每组n = 6， ns为P > 0.05，*为P < 0.05。

三、大鼠血清、脑脊液中IL-18的浓度

与Sham组大鼠相比，TBI组、TBI+IL-18BP组大鼠血清和脑脊液中IL-18的浓度升高；与TBI组大鼠相比，TBI+IL-18BP组大鼠的IL-18浓度降低（P均< 0. 05）。见表3。
表3 大鼠术后第30日血清和脑脊液中的IL-18浓度$(\bar{x} \pm s)$ 单位：ng/mL
组 别 只数 血清IL-18 脑脊液IL-18
Sham组 12 106.56±8.32 99.75±7.25
TBI组 12 265.35±21.43a 249.30±18.50a
TBI+IL-18BP组 12 204.15±14.54b 196.10±11.84b
F值 311.500 386.500
P值 <0.001 <0.001

注：与Sham组相比，aP < 0.05； 与TBI组相比，bP < 0.05。

四、大鼠杏仁核区NLRP3/GFAP、IL-18/GFAP双阳性星形胶质细胞百分比

与Sham组大鼠相比，TBI组、TBI+IL-18BP组大鼠杏仁核区NLRP3/GFAP和IL-18/GFAP双阳性星形胶质细胞数量均增加；与TBI组相比，TBI+IL-18BP组大鼠杏仁核区双阳性星形胶质细胞数量减少（P均< 0.05）。见图3~4。
图3 大鼠术后第30日杏仁核区NLRP3/GFAP、IL-18/GFAP双阳性星形胶质细胞（免疫荧光染色）

注：A为NLRP3；B为IL-18；蓝色为DAPI阳性，红色为GFAP阳性，绿色为NLRP3、IL-18阳性；每组n = 6， 标尺=100 μm。

图4 大鼠术后第30日杏仁核区NLRP3、IL-18阳性星形胶质细胞比例统计图

注：每组n = 6， *P < 0.05。

五、杏仁核区焦亡相关指标的变化

3组大鼠术后第30日杏仁核区NLRP3、cl-Caspase-1、GSDMD的表达量差异均具统计学意义（F分别为1195.000、265.700、613.500，P均< 0.050）。与Sham组相比，TBI组、TBI+IL-18BP组杏仁核区NLRP3、cl-Caspase-1、N-GSDMD的表达均上调；与TBI组相比，TBI+IL-18BP组杏仁核区NLRP3、cl-Caspase-1、GSDMD的表达均下调（P均< 0.05）。见图5。
图5 大鼠术后第30日杏仁核区NLRP3、cl-Caspase-1、N-GSDMD的相对表达量

注：每组n = 6， *P < 0.05。

讨论

TBI是世界范围内致残与致死的主要原因之一，给全球公共卫生带来了巨大的威胁，给社会造成了沉重的经济负担[9]。TBI会导致长期的情绪紊乱，如抑郁和焦虑[10]。本研究结果显示大鼠TBI后出现焦虑样行为，与既往研究结果一致。
TBI后损伤相关分子模式（DAMP）等内源性介质在局部和全身释放，被先天免疫系统识别后可激活NLRP3，随后NLRP3通过N端的PYD结构域募集前Caspase-1分子，前Caspase-1二聚体自我蛋白酶解，形成p10或p20片段的裂解碎片，激活前炎症因子IL-1β和IL-18，也可通过激活GSDMD来诱发细胞焦亡[11⇓-13]。细胞焦亡与TBI的神经功能恢复有着紧密的关系[14-15]。本研究中TBI大鼠杏仁核区NLRP3、cl-Caspase-1、N-GSDMD表达均上调，与既往研究结果一致。杏仁核是一种边缘大脑结构，对情绪调控、学习记忆能力至关重要[16]。既往有研究证实TBI后星形胶质细胞激活明显增多[17-18]。本研究中TBI大鼠杏仁核区星形胶质细胞激活增多，星形胶质细胞内NLRP3与IL-18表达上调，提示TBI可诱发杏仁核区星形胶质细胞焦亡，此病理改变可能与大鼠的焦虑样行为相关。
有研究报道IL-18参与调节TBI后大脑神经细胞焦亡[7]。本研究中TBI大鼠血清和脑脊液中IL-18浓度上调，IL-18阳性的星形胶质细胞表达亦上调。IL-18BP为IL-18特异性抑制剂，可减轻失血性休克小鼠的焦虑样行为[19]。本研究中TBI大鼠注射IL-18BP后焦虑样行为改善，且IL-18BP减少了TBI大鼠杏仁核区星形胶质细胞的激活，NLRP3、IL-18阳性的星形胶质细胞数量减少，杏仁核区焦亡相关蛋白的表达也下调。
本研究的不足之处：只验证了杏仁核区的变化，对于情绪控制相关的其他脑区如腹内侧前额叶皮质、边缘系统中边缘皮层内的海马和扣带回、伏隔核等均未进行研究；在TBI后诱发的炎性反应中只关注了星形胶质细胞的变化，缺少小胶质细胞、少突胶质细胞变化的研究。本研究团队将在下一步实验中进一步观察。
综上所述，IL-18BP能一定程度减轻TBI大鼠的焦虑样行为，可能与减轻星形胶质细胞的焦亡密切相关。

References

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[1]
吕雯奇, 李仕鹏, 周贤喆, 等. 神经血管单元功能障碍在创伤性颅脑损伤后神经变性中的作用机制. 中华神经医学杂志, 2020, 19(8):844-848.

[2]
Li Y, Zhang L M, Zhang D X, et al. CORM-3 ameliorates neurodegeneration in the amygdala and improves depression- and anxiety-like behavior in a rat model of combined traumatic brain injury and hemorrhagic shock. Neurochem Int, 2020, 140:104842.

DOI

[3]
Zhang D X, Zheng W C, Bai Y, et al. CORM-3 improves emotional changes induced by hemorrhagic shock via the inhibition of pyroptosis in the amygdala. Neurochem Int, 2020, 139:104784.

DOI

[4]
Ihim S A, Abubakar S D, Zian Z, et al. Interleukin-18 cytokine in immunity, inflammation, and autoimmunity: biological role in induction, regulation, and treatment. Front Immunol, 2022, 13:919973.

DOI

[5]
Lammert C R, Frost E L, Bellinger C E, et al. AIM2 inflammasome surveillance of DNA damage shapes neurodevelopment. Nature, 2020, 580(7805):647-652.

DOI

[6]
Kuwar R, Rolfe A, Di L, et al. A novel small molecular NLRP 3 inflammasome inhibitor alleviates neuroinflammatory response following traumatic brain injury. J Neuroinflammation, 2019, 16(1):81.

DOI

[7]
Park S Y, Hisham Y, Shin H M, et al. Interleukin-18 binding protein in immune regulation and autoimmune diseases. Biomedicines, 2022, 10(7):1750.

DOI

[8]
Rex D A B, Agarwal N, Prasad T S K, et al. A comprehensive pathway map of IL-18-mediated signalling. J Cell Commun Signal, 2020, 14(2):257-266.

DOI PMID

[9]
侯依琳, 赵又谊, 轩润康, 等. 增强反应性星形胶质细胞Wnt/β-catenin信号改善小鼠脑创伤后焦虑. 神经解剖学杂志, 2021, 37(1):28-34.

[10]
Popovitz J, Mysore S P, Adwanikar H. Long-term effects of traumatic brain injury on anxiety-like behaviors in mice: behavioral and neural correlates. Front Behav Neurosci, 2019, 13:6.

DOI PMID

[11]
O’Brien W T, Pham L, Symons G F, et al. The NLRP3 inflammasome in traumatic brain injury: potential as a biomarker and therapeutic target. J Neuroinflammation, 2020, 17(1):104.

DOI

[12]
Yuan D, Guan S, Wang Z, et al. HIF-1alpha aggravated traumatic brain injury by NLRP 3 inflammasome-mediated pyroptosis and activation of microglia. J Chem Neuroanat, 2021, 116:101994.

DOI

[13]
Irrera N, Russo M, Pallio G, et al. The role of NLRP 3 inflammasome in the pathogenesis of traumatic brain injury. Int J Mol Sci, 2020, 21(17):6204.

DOI

[14]
Hu X, Chen H, Xu H, et al. Role of pyroptosis in traumatic brain and spinal cord injuries. Int J Biol Sci, 2020, 16(12):2042-2050.

DOI PMID

[15]
Chang Y, Zhu J, Wang D, et al. NLRP3 inflammasome-mediated microglial pyroptosis is critically involved in the development of post-cardiac arrest brain injury. J Neuroinflammation, 2020, 17(1):219.

DOI

[16]
Simic G, Tkalcic M, Vukic V, et al. Understanding emotions: origins and roles of the amygdala. Biomolecules, 2021, 11(6):823.

DOI

[17]
Michinaga S, Koyama Y. Pathophysiological responses and roles of astrocytes in traumatic brain injury. Int J Mol Sci, 2021, 22(12):6418.

DOI

[18]
Gao X, Li W, Syed F, et al. PD-L1 signaling in reactive astrocytes counteracts neuroinflammation and ameliorates neuronal damage after traumatic brain injury. J Neuroinflammation, 2022, 19(1):43.

DOI

[19]
Zhang L M, Zhang D X, Song R X, et al. IL-18BP alleviates anxiety-like behavior induced by traumatic stress via inhibition of the IL-18R-NLRP 3 signaling pathway in a mouse model of hemorrhagic shock and resuscitation. Molecular Neurobiology, 2022, 60(1):382-394.

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