卵巢癌是女性生殖系统的三大恶性肿瘤之一，流行病学数据显示我国每年新发卵巢癌患者约5.2万例，因卵巢癌死亡的患者约2.2万例，是病死率最高的妇科恶性肿瘤[1-2]。由于肿瘤复发和转移以及化学治疗（化疗）耐药等原因，卵巢癌的5年生存率仅约30%，许多患者在就诊时已经出现了腹膜转移[3]。因此，探索有效的基因生物标志物以帮助早期发现肿瘤转移，对于提高治疗效果、改善卵巢癌患者预后尤为重要。甲状腺转录因子1（TTF-1）也称为NKX同源框-1（NKX2-1），位于人类染色体14q13.3，是由3个外显子和2个内含子组成的、单基因编码的、含有一个同源结构域的转录因子[4]。细胞周期蛋白D1（CyclinD1）基因定位于人染色体11q13，是细胞周期素家族中最主要的成员之一，对细胞周期起正向调控作用[5]。文献报道，TTF-1在肺癌的发生、发展中发挥重要作用，CyclinD1则在肺癌、食管癌等恶性肿瘤中呈过表达，但关于这两个基因对卵巢癌影响的研究很有限，作用机制尚未阐明[6-7]。本研究拟通过分析卵巢癌组织中TTF-1、CyclinD1蛋白的表达及其与临床分期、淋巴管密度（LVD）等指标之间的关联，探讨其与临床病理特征和淋巴管转移间的相关性，为早期诊断卵巢癌转移和开展治疗提供参考。
材料与方法
一、标本来源
本研究的标本来自2018年1月至2020年12月在本院就诊的60例卵巢癌患者，患者年龄为（48.7±9.5）岁。另收集20例经病理检查证实的正常卵巢组织作为对照，患者年龄为（46.8±9.1）岁。2组标本来源患者的年龄比较差异无统计学意义（t = 0.780，P = 0.438）。本研究方案通过医院伦理委员会批准（批件号：L[2022]第18号），患者均已签署知情同意书。
二、纳入与排除标准
卵巢癌患者纳入标准：①年龄≥18岁；②接受手术治疗，病理结果证实为卵巢癌；③手术前未经任何治疗；④患者依从性佳，按期复查，随访资料完整。对照者纳入标准：①年龄≥18岁；②因卵巢占位、子宫肌瘤、功能性子宫出血接受卵巢切除治疗，病理结果证实为良性卵巢肿瘤或正常卵巢组织；③患者依从性佳，按期复查，随访资料完整。排除标准：①患有难以控制的糖尿病、肝肾功能不全、心血管疾病、脑血管疾病、血液系统疾病、自身免疫性疾病等全身性疾病；②孕产妇或患有其他严重精神或心理疾病。
三、主要试剂与材料
鼠抗人TTF-1、CyclinD1、D2-40单克隆抗体均购自北京中杉科技有限公司，辣根过氧化物酶标记IgG-HRP购自北京福盛科技有限公司，Dako REALTM免疫组织化学（免疫组化）染色试剂盒购自基因科技（上海）有限公司，磷酸盐缓冲液（PBS）购自上海金桥生物科技有限公司。
四、免疫组化染色
组织标本经10%甲醛溶液固定后，石蜡包埋，以5 μm厚进行连续切片，制备成组织切片。将切片置于烘箱内烘烤1 h后，再经脱蜡及水化，0.3% H2O2孵育30 min，PBS冲洗5 min，共3次。加柠檬酸抗原修复液，加热10 min去除内源性过氧化物酶，自然冷却至室温。加入一抗（1∶100 TTF-1或1∶200 CyclinD1或1∶200 D2-40），4℃孵育过夜，PBS冲洗5 min，共3次，加入生物素标记的二抗，室温孵育20 min，PBS冲洗后DAB显色，苏木素复染，中性树胶封片。
五、染色结果评价
由2名具有副主任医师或以上职称的病理科医师基于双盲原则对所有染色切片按半定量积分法进行评价：首先在400倍光镜下，随机选取10个视野分析阳性细胞百分比，视野内的阳性细胞百分比≥70%为3分，30%≤阳性细胞百分比<70%为2分，5%≤阳性细胞百分比<30%为1分，阳性细胞百分比<5%为0分；然后评价染色强度，胞浆或核膜呈棕褐色为3分，呈棕黄色为2分，呈浅黄色为1分，仅细胞核呈蓝色为0分。把阳性细胞百分比评分与阳性细胞染色强度评分相加获得总分，总分在0~3分为阴性，4~6分为阳性。
六、LVD测定
由2名具有副主任医师或以上职称的病理科医师基于双盲原则对所有切片进行评估。依据Weidner的评价方法，首先在低倍镜下寻找肿瘤细胞周围的D2-40阳性淋巴管密集区域（热区），然后在200倍光镜下，随机选取5个视野，计数淋巴管数量，最后计算平均值，作为LVD[8]。
七、统计学处理
使用SPSS 22.0进行数据分析。计量资料经Shapiro-Wilk检验均符合正态分布，以$\bar{x}±s$表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。计数资料以例（%）表示，组间比较采用χ 2检验或Fisher确切概率法。 P<0.05为差异有统计学意义。
结果
一、60例卵巢癌患者的临床病理特征
60例卵巢癌患者中，根据国际妇产科联盟（FIGO）手术病理分期标准Ⅰ期11例、Ⅱ期9例、Ⅲ期35例、Ⅳ期5例；根据术后病理学检查结果，浆液性腺癌31例、黏液性腺癌17例、子宫内膜样癌12例；高分化癌22例、低分化癌38例；淋巴结转移阳性35例、阴性25例；腹膜转移阳性20例、阴性40例。
二、卵巢癌组织与正常卵巢组织的TTF-1、CyclinD1和D2-40表达情况
TTF-1阳性呈棕黄色细颗粒，主要表达于细胞的胞浆及基质血管内皮内，阳性细胞呈局灶性或弥漫性分布。在60例卵巢癌组织中，TTF-1的阳性表达率为58%（35/60）；在20例正常卵巢组织中，TTF-1阳性表达率为5%（1/20），组间比较差异有统计学意义（P < 0.001）。CyclinD1阳性呈棕黄色或棕褐色颗粒，主要表达于细胞质及细胞膜，呈弥漫性分布。在60例卵巢癌组织中，CyclinD1的阳性表达率为83%（50/60）；在20例正常卵巢组织中，CyclinD1阳性表达率为10%（2/20），组间比较差异有统计学意义（P < 0.001）。D2-40阳性呈棕黄色细颗粒，在卵巢癌组织中均有表达，主要表达于淋巴内皮细胞的胞质内，无管腔的淋巴管多于有管腔淋巴管，在肿瘤细胞的细胞质中偶见D2-40表达。见图1。
三、TTF-1、CyclinD1与卵巢癌临床病理指标的关联
病理分期Ⅲ~Ⅳ期、淋巴结转移阳性、腹膜转移阳性、T3~T4期、N1期和M1期的卵巢癌组织中的TTF-1及CyclinD1的阳性表达率均较高（P均< 0.05）；而与患者年龄、组织学类型无关（P均> 0.05）。见表1。
表1 TTF-1、CyclinD1与卵巢癌临床病理指标的关系[例（%）] |
| 指 标 | 例数 | TTF-1 | CyclinD1 | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 阳性 | χ2值 | P值 | 阳性 | χ2值 | P值 | |||
| 年龄 | 0.049 | 0.825 | 0.343 | 0.558 | ||||
| ≤50岁 | 35 | 20（57） | 30（86） | |||||
| >50岁 | 25 | 15（60） | 20（80） | |||||
| 组织学类型 | 0.002 | 0.965 | 0.334 | 0.563 | ||||
| 浆液型 | 31 | 18（58） | 25（81） | |||||
| 非浆液型 | 29 | 17（59） | 25（86） | |||||
| 病理分期 | 4.419 | 0.042 | 7.260 | 0.007 | ||||
| Ⅰ~Ⅱ期 | 20 | 8（40） | 13（65） | |||||
| Ⅲ~Ⅳ期 | 40 | 27（68） | 37（93） | |||||
| 淋巴结转移 | 25.910 | <0.001 | — | 0.012a | ||||
| 阳性 | 35 | 30（86） | 33（94） | |||||
| 阴性 | 25 | 5（20） | 17（68） | |||||
| 腹膜转移 | — | <0.001a | — | 0.023a | ||||
| 阳性 | 20 | 19（95） | 20（100） | |||||
| 阴性 | 40 | 16（40） | 30（75） | |||||
| T分期 | 8.389 | 0.015 | 16.799 | <0.001 | ||||
| T1期 | 5 | 1（20） | 2（40） | |||||
| T2期 | 10 | 3（30） | 6（60） | |||||
| T3~T4期 | 45 | 31（69） | 42（93） | |||||
| N分期 | 25.910 | <0.001 | 5.591 | 0.018 | ||||
| N0期 | 25 | 5（20） | 17（68） | |||||
| N1期 | 35 | 30（86） | 33（94） | |||||
| M分期 | — | <0.001a | — | 0.040a | ||||
| M0期 | 36 | 13（36） | 27（75） | |||||
| M1期 | 24 | 22（92） | 23（96） | |||||
注：aFisher确切概率法。 |
四、LVD与卵巢癌临床病理指标的关联
卵巢癌组织中，病理分期Ⅲ~Ⅳ期、淋巴结转移阳性、腹膜转移阳性、T3~T4期、N1期和M1期的卵巢癌组织LVD均较高（P均< 0.05）。年龄、组织学类型与卵巢癌组织LVD无关（P均> 0.05）。见表2。
表2 LVD与卵巢癌临床病理指标的关系 单位：个/200倍视野 |
| 指 标 | 例数 | LVD | t/F值 | P值 |
|---|---|---|---|---|
| 年龄 | 0.542 | 0.590 | ||
| ≤50岁 | 35 | 10.92±3.57 | ||
| >50岁 | 25 | 11.45±3.91 | ||
| 组织学类型 | 0.275 | 0.784 | ||
| 浆液型 | 31 | 11.13±4.02 | ||
| 非浆液型 | 29 | 10.85±3.96 | ||
| 病理分期 | 5.672 | <0.001 | ||
| Ⅰ~Ⅱ期 | 20 | 9.63±3.18 | ||
| Ⅲ~Ⅳ期 | 40 | 15.24±3.85 | ||
| 淋巴结转移 | 6.155 | <0.001 | ||
| 阳性 | 35 | 16.05±4.82 | ||
| 阴性 | 25 | 9.72±3.13 | ||
| 腹膜转移 | 4.933 | <0.001 | ||
| 阳性 | 20 | 15.81±4.05 | ||
| 阴性 | 40 | 10.46±3.92 | ||
| T分期 | 10.039 | 0.005 | ||
| T1期 | 5 | 6.78±2.53a | ||
| T2期 | 10 | 9.65±3.07a | ||
| T3~T4期 | 45 | 12.52±3.14 | ||
| N分期 | 6.161 | <0.001 | ||
| N0期 | 25 | 9.72±3.13 | ||
| N1期 | 35 | 16.05±4.82 | ||
| M分期 | 5.765 | <0.001 | ||
| M0期 | 36 | 8.91±2.85 | ||
| M1期 | 24 | 13.82±3.75 |
注：与T3~T4期比较，aP < 0.05。 |
五、卵巢癌组织中TTF-1、CyclinD1表达与LVD的关联
阳性表达TTF-1、CyclinD1的卵巢癌组织中的LVD均高于阴性表达TTF-1、CyclinD1的卵巢癌组织（P均< 0.05）。见表3。
表3 卵巢癌组织中TTF-1、CyclinD1与LVD的关系 单位：个/ 200倍视野 |
| 指 标 | 例数 | LVD | t值 | P值 |
|---|---|---|---|---|
| TTF-1 | 6.161 | <0.001 | ||
| 阳性 | 35 | 16.05±4.82 | ||
| 阴性 | 25 | 9.72±3.13 | ||
| CyclinD1 | 15.028 | <0.001 | ||
| 阳性 | 50 | 27.03±3.63 | ||
| 阴性 | 10 | 8.52±3.12 |
讨论
CyclinD1是一种细胞周期调控蛋白，在正常细胞中于G1期产生，通过依赖或不依赖细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）途径参与细胞周期G1/S转化的调控[16]。多项研究报道，在肿瘤细胞中，翻译后蛋白稳定等多种机制可促进CyclinD1高表达，导致致癌因子与其发生相互作用，使细胞周期紊乱，更多的细胞进入细胞增殖周期，造成失控性生长，最终引起恶性肿瘤进展[17-18]。有学者报道，CyclinD1在乳腺癌组织中的表达水平高于正常乳腺组织，并通过干预细胞增殖、侵袭和凋亡等生物学过程，促进肿瘤进展[19]。本研究显示，CyclinD1在乳腺癌组织中的阳性表达率高达83%，且阳性表达率随着淋巴结转移、腹膜转移而增加，与既往研究结果相符。
肿瘤的淋巴转移包括淋巴浸润、局部淋巴管扩张、新生淋巴管生成、局部淋巴结转移和远处淋巴结转移等多个过程，其中以LVD升高为表现的新生淋巴管增加是促进肿瘤转移的重要机制[20]。本研究中采用了经典的D2-40免疫组化染色来评价淋巴管数量的变化，结果显示病理分期Ⅲ~Ⅳ期、淋巴结转移、腹膜转移、T3~T4期、N1期和M1期的卵巢癌组织的LVD明显增加，符合恶性肿瘤的淋巴转移和进展机制。此外，阳性表达TTF-1、CyclinD1的卵巢癌组织中LVD高于阴性组织，表明TTF-1、CyclinD1在卵巢癌的淋巴管生成和转移过程中发挥了重要作用。
综上所述，TTF-1与CyclinD1在卵巢癌组织中呈现为高表达，促进了卵巢癌的病情进展、淋巴管生成和转移，可作为卵巢癌干预的潜在新靶点。TTF-1、CyclinD1在恶性肿瘤转移过程中的作用机制还需要将来进一步深入研究，这有可能成为新型治疗手段的研发方向。