牙周病作为成人缺牙的主要原因，主要是指由牙周致病菌感染所引起的，发生在牙周支持组织的慢性细菌性感染性疾病，在全球范围内普遍存在[1⇓⇓-4]。牙周病导致的口腔内微生物稳态的破坏，还可能增加各种全身疾病的发生风险，例如类风湿性关节炎、结肠炎、系统性红斑狼疮、心肌梗死和阿尔茨海默病等[5⇓⇓-8]。因此，有效治疗牙周炎并促进牙周组织再生对人类健康至关重要。传统的牙周治疗包括基础治疗、手术治疗、全身和局部施用抗生素等，在恢复牙周组织的生理结构和功能上，受主动诱导组织再生修复能力缺失的影响，均无法实现理想的牙槽骨再生效果[9]。在分子生物学、细胞生物学、组织工程技术有着更深入研究的背景下，在促进牙槽骨再生方面，联合使用组织工程和基因靶向治疗及干细胞归巢技术广受期望。本研究拟构建壳聚糖/BMP-2质粒温敏水凝胶复合修复体系CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP，研究该复合体系在犬牙槽骨再生中的作用。
材料与方法
一、材料
1. 动物
4只29月龄比格犬，体质量15~16 kg，购自青岛博隆实验动物有限公司。
2. 试剂与仪器
三聚磷酸钠（TPP，医药级，含量99％）购自上海精细化工材料研究所；pDNA-BMP2购自青岛大学医学院中心实验室；多聚甲醛粉、α，β-GP（分析纯）购自国药集团化学试剂有限公司；壳聚糖（医级，脱乙酰度90%）购自桓台县金湖甲壳制品有限公司；SM2000R型病理组织切片机（Leica Biosystems，德国）。本研究已获得青岛大学医学院附属医院伦理委员会批准。
二、方法
1. CS/CSn-GP支架与CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP复合支架的制备
①称取0.1 g CS，用0.1 mol/L乙酸定容至100 mL，搅拌1 h，得到1 mg/mL的CS溶液。②称取0.1 g的TPP，用三蒸水定容至100 mL，得到1 mg/mL 的TPP溶液。③吸取0.5 mL的TPP（aq）和5 mL的CS（aq），质量比为1∶10，进行搅拌，时长为0.5 h，然后进行5 min超声震荡，静置15 min，进行过滤处理，获得无菌CSn溶液。④取1 μL pDNA-BMP2与10 μL CSn加入Eppendorf管中，室温下均匀漩涡30 s，即可制备成N/P等于5∶1的CSn （pDNA-BMP2）。⑤取0.2 g CS，加入8 mL的0.1 mol/L乙酸，使用磁力搅拌器进行搅拌，持续时长为2 h，待充分溶解后进行除杂，过滤，使用高压蒸汽进行灭菌（设置的条件为121 ℃，10 min），置入4 ℃冰箱保存；使用2 mL双蒸水溶解0.56 g α，β-GP，而后磁力搅拌器持续搅拌5min至充分溶解，使用滤膜（孔径为0.22 μm）过滤后，在4 ℃冰箱中保存滤液。对以上两种溶液，进行15 min的冰浴，然后以2∶8的比例，在CS溶液中逐滴加入α，β-GP与CS溶液，并进行10 min的持续搅拌，就能够获得质量浓度为2%的CS溶液和5.6%质量浓度的α，β-GP凝胶溶液。溶胶经37 ℃的恒温水浴后，转变为凝胶，形成Cs/α，β-GP温敏水凝胶。⑥取适量CS/CSn（pDNA-BMP2），加入Cs/α，β-GP温敏水凝胶中，进行磁力搅拌，使得纳米粒能够均匀散布，从而实现CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP复合体系的制备。⑦使用等量的去离子水，替代以上制备中使用的pDNA-BMP2，不变动其他步骤，就可实现CS/CSn-GP复合修复体系的制备。
2. CS/CSn-GP复合支架系统及CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP复合修复体系的性质检测
扫描电镜观察：取少量的CS/CSn-GP溶液真空喷金，对表面形态进行检测并拍照。
温敏性测定：制备CS/CSn-GP复合支架系统及CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP复合修复体系，采用试管倒置法检测水凝胶在室温37 ℃时的溶胶-凝胶转变。
3. 实验动物模型的建立及分组
根据Kim等[10]建模方法建立第二、三前磨牙牙周炎模型。从4只比格犬第二、三前磨牙（共32颗牙，16象限）选取15个象限的30颗牙齿随机分成3组：每个象限内牙齿为同一组，每组包含5个象限的10颗牙齿，A组为CS/CSn （pDNA-BMP2） -GP组（n=10），B组为CS/CSn-GP组（n=10），C组为空白对照组（n=10）。实验使用的各种器械进行高压消毒，动物称重后，速眠新Ⅱ 0.4~0.8 mg/kg肌注麻醉。对口内、口外使用碘酊进行消毒，铺无菌巾，对实验牙行翻瓣术，翻开黏膜骨膜瓣至前庭沟，对根面作平整处理，对残留肉芽组织进行去除，结合分组的差异，置入相应材料。A组注入CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP复合体，B组注入CS/CSn-GP复合体，C组作为空白对照组仅做手术，不注入任何修复材料，组织瓣冠向复位，以4-0号线缝合。在术后5 d内，连续肌注青霉素2×106单位，以避免发生感染；流质软食喂养1周，以避免术区受到咬合力的影响。术后8周，处死实验犬，取颌骨，标本分切，常规4%多聚甲醛固定。行Masson染色观察新生骨组织。行钙钴法测定ALP强度表达。
三、统计学处理
采用SPSS 19.0和GraphPad Prism 5.0进行统计分析。正态分布定量资料用$\bar{x}±s$表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法。α=0.05（双侧）。
结果
一、扫描电镜观察
二、温敏性测定
CS/CSn-GP和CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP复合修复体系溶胶-凝胶转变速率与温度、时间的关系见表1。在25 ℃下，CS/CSn-GP和CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP复合修复体系可长时间保持溶胶状，而在37 ℃下，3 min内就能够向凝胶状转变。
表1 CS/CSn-GP和CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP复合修复体系在 25 ℃和 37 ℃的成胶时间 |
| 修复体 | 25 ℃ | 37 ℃ | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 min | 3 min | 5 min | 7 min | 1 min | 3 min | 5 min | 7 min | ||
| CS/CSn-GP | － | － | － | － | － | + | + | + | |
| CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP | － | － | － | － | － | + | + | + | |
注：－表示不成胶，＋表示成胶。 |
三、Masson染色结果
NB及PDL高度统计结果见图4。CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP组NB高度最高，CS/CSn-GP组次之，空白对照组最低，两两比较差异均有统计学意义（P均< 0.05）。CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP组与CS/CSn-GP组PDL高度无统计学差异（P > 0.05），而2组与空白对照组相比，差异均有统计学意义（P均< 0.01）。
四、ALP活性测定
3组ALP阳性部位的平均光密度（AOD）统计结果见图6。结果表明：CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP 组最高，CS/CSn-GP组次之，空白对照组最低，两两比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。
讨论
在组织再生领域内，可原位注射和生物降解的温敏水凝胶应用非常广泛[11]。它主要有以下优点：第一，温敏水凝胶在室温状态下为稳定流体状，而在机体体温下，水凝胶会由流体变为胶体。故而，在局部治疗中，只需要利用注射器就能够向病变位置进行温敏水凝胶的靶向注入，无需进行手术，使得手术创伤能够尽可能地减轻，让患者获得更好的舒适度和接受度。第二，对注射型生物材料尤为重要的是，流体状的温敏水凝胶能够随着注射位置的变化而形成不定形水凝胶，从而避免受形状不规则的影响发生机体损伤。第三，载药性温敏水凝胶能够实现对药物的持续缓释，不只是在改善药物不良反应及减少给药次数上有积极效果，对提升治疗靶向性、改善患者的舒适度等也有着积极作用。在组织工程技术进一步发展的背景下，在基因传递载体的研究中，纳米粒的研究是热点。作为天然的阳离子多糖，壳聚糖的生物相容性良好，可与DNA有效结合，对DNA能够起到保护作用，以免被核酸酶降解，故而是非病毒基因传递的理想载体之一[12⇓-14]。壳聚糖纳米粒的制备，可运用的方法较多，具体有共价交联法、乳化交联法、离子交联法、去溶剂法、大分子复合法[15-16]。其中，离子交联法采用TPP交联剂对壳聚糖进行离子诱导，进行壳聚糖纳米粒的制备。离子交联法在室温条件下就可实现，具有较好的可行性，反应条件温和，不需要使用到有机溶剂，制备出的纳米粒在粒径上可调且尺寸均一，是最多使用到的一种制备方法[17]。在本研究中，采用离子交联法制备CS/CSn-GP和CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP复合修复体系。
采用试管倒置法对CS/CSn-GP和CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP复合修复体系温敏性进行检测表明，在25 ℃下，两者均为溶胶状，而在37 ℃下，3 min内两者就能够向凝胶状转变。反映出CS/CSn-GP复合支架的温敏性良好，而CSn（pDNA-BMP2）的加入对温敏性并不存在影响。壳聚糖具有的矩阵结构对细胞增殖具有积极影响，能够使得细胞微环境中壳聚糖的浓度保持在较高水平，从而使得基因的表达获得延长，并使得基因治疗具有更好效果[21]。如果CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP复合修复体系由溶液变成水凝胶，常规孔和多孔结会构成交联网络。水凝胶显现出的形态特征，对水和小分子的自由移动是有利的。扫描电镜显示，在支架中CSn（pDNA-BMP2）呈均布状，并嵌入支架支柱内，反映出CSn（pDNA-BMP2）与支架有着紧密的结合。纳米粒子和支架的三维结构，能够对pDNA-BMP2起到保护作用，避免发生快速扩散与降解。充分表明，CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP复合修复体系是潜力巨大的基因载体支架系统。
部分研究显示，对PCLDs增殖及向成骨方向分化，BMP-2能够起到诱导作用，如果将BMP-2 与材料复合，进行细胞支架的制备，能够显著改善牙周再生效率，而它功能的发挥，主要依赖的是改善细胞的ALP活性，提高骨钙蛋白和胶原蛋白含量[22]。对成骨细胞的分化趋势，ALP水平的高低可予以客观表征。在本实验中，应用CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP复合修复体系后，与其他2组相比较，ALP活性明显更高；在仅应用CS/CSn-GP组的情形下，与空白对照组相比较，ALP活性更高。反映出，在促进牙槽骨再生方面，CS/CSn-GP复合修复体系有着良好的能力，包载pDNA-BMP2后，能够显著提升成骨能力；此外，在CS/CSn-GP复合修复体系与一定量的BMP-2复合后，Masson染色观察到在8周有出现明显的新生牙槽骨样结构，反映出牙周膜细胞受成骨诱导因子的刺激作用，在支架中实现成骨向分化，且有着明显的效果。故而说明，CS/CSn-GP复合修复体系是pDNA-BMP2的良好载体。
本实验表明：CS/CSn-GP复合修复体系对牙槽骨再生有着积极影响，包载pDNA-BMP-2后，有着更显著的促牙槽骨再生作用。本研究对在牙周骨组织缺损修复中应用CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP 复合体系的可行性问题作了初步分析，为后期实验奠定了基础。