细胞外囊泡（EV）是细胞在静息或应激状态下释放的各种具有脂质双层膜结构的囊泡总称,囊泡的直径从数十纳米至数微米。几乎所有活细胞均可释放EV,它们存在于各种生物流体中,如血液、唾液、尿液以及细胞外环境等。
越来越多的证据表明,EV中包含母细胞相关的蛋白质（如CD9、CD63、CD81、MHC-I等）、脂类、核苷酸[包括DNA、信使RNA（mRNA）、微小RNA（miRNA）、环状RNA（cirRNA）及其他非编码RNA]和糖等多种生物活性物质,通过靶细胞内化、受体-配体间相互作用或脂质膜融合等方式,广泛参与细胞之间的信息传递,对维持各种生理过程至关重要,如免疫监视、凝血、干细胞维护、组织修复等。此外,有研究发现EV还参与传染病和炎症、神经系统疾病和癌症等多种病理过程,可用于监测疾病进展和治疗反应等,同时由于它们具有递送生物活性物质的功能,可开发成为新的药物载体。这些EV的存在为多方位、多角度揭示疾病发生、发展机制提供了丰富的生物学信息,有望成为生物医学研究和应用开发的技术平台[1]。近年来研究发现,间充质干细胞（MSC）来源的EV具有与MSC相似的生物学效应,如减少细胞凋亡、减轻炎症反应、促进血管生成、抑制纤维化、提高组织修复潜力等,而且易提取、改造,与干细胞移植相比致瘤风险低,在损伤修复的生物学治疗中具有广阔应用前景[2]。
鉴于EV具有重要生物学功能、广阔的研究和应用前景,近年来对EV的研究呈指数性增长,作为一个新兴领域受到学者的广泛关注。然而,由于EV的体积非常小,对其分离、观察和鉴定具有一定的挑战性,寻找高效的EV分离和鉴定方法是研究的前提。本文就上述问题进行文献综述,为EV的研究提供一定的参考。
一、EV的分类、产生机制及特征
根据EV的生成方式、大小或功能不同,可以分为起源于内吞途径的外泌体、质膜释放的微囊泡和细胞凋亡产生的凋亡小体3种亚群[1]。
3种EV亚群的产生机制不同。外泌体起源于细胞的内涵体系统[2]。首先细胞膜内陷形成初级内涵体,内涵体膜再次内陷形成多个腔内小泡,此时包含多个腔内小泡的内涵体即次级内涵体也叫做多囊泡体。多囊泡体是真核细胞重要的蛋白运输与分拣中心,当多囊泡体与胞膜融合后,其内的管腔状囊泡凹陷,以内出芽方式形成直径为30 ~ 120 nm颗粒状小囊泡,并释放入细胞外环境,即外泌体。微囊泡是细胞质膜直接以“出苞”的方式向细胞外突出形成的大囊泡,直径为100 ~ 1000 nm。凋亡细胞的胞膜内陷,分割包裹核碎裂形成的染色质块（核碎片）和胞质,然后通过出苞或起泡等方式,从细胞脱落形成一些大小不等的囊泡,即凋亡小体。此外,凋亡细胞内线粒体、内质网等细胞器和胞质成分被内质网膜包裹形成自噬体,与凋亡细胞膜融合后,排出体外也可形成凋亡小体,直径800 ~ 5000 nm。这3种EV亚群的特征见表1。本文中EV主要指外泌体和微囊泡。
表1 3种EV亚群的主要特征 |
| 特 征 | 外泌体 | 微囊泡 | 凋亡小体 |
|---|---|---|---|
| 大小（nm） | 30 ~ 120 | 100 ~ 1000 | 800 ~ 5000 |
| 形态 | 杯状 | 多样 | 多样 |
| 起源 | 多囊泡体 | 细胞质膜 | 细胞质膜 |
| 形成机制 | 多囊泡体胞外分泌 | 细胞质膜出苞方式 | 细胞质膜出苞方式 |
| 通路 | ESCRT-依赖性 | Ca2+依赖性 | 凋亡相关通路 |
| 四跨膜蛋白依赖性 | 刺激和细胞依赖性（不同通路） | ||
| 释放时间 | 10 min或更久 | 几十分之一秒 | |
| 富含蛋白标志物 | CD81、CD63、Alix、 Tsg101 | 选择素、整合素、CD40 | Caspase 3、组蛋白 |
| 组成 | 蛋白质、脂质、编码RNA、非 编码RNA、DNA | 蛋白质、脂质、细胞器、编码RNA、非编码RNA、DNA | 细胞器、蛋白质、核酸片段、编码RNA、非编码RNA,DNA |
EV的组成成分并非随机的,研究表明,细胞在不同的状态分泌的EV内含物不同,每一个EV都会携带特定的分子信息,包装的独特分子构成决定了要传递给受体细胞的细胞外信号的类型,而且由一个复杂的分选系统来决定那些分子能够进入细胞外囊泡[3]。4种不同的机制可用于描述这种“货物”装载方式：转运需要的内涵体分选复合物（ESCRT）机器及相关蛋白质、大量脂质、高阶聚化反应、通过神经酰胺分离成微区。
二、分离方法
EV的体积小、密度低,分离难度大,而且不同的分离方法得到的EV理化性质不同,这导致了EV研究存在大量不可控性和难重复性,是制约EV研究和应用转化的最主要因素[4]。利用EV的物理和生物化学性质,已经开发了许多分离技术,如超速离心法、密度梯度离心法、免疫吸附法、沉淀法、基于微流控的分离技术等[5]。但是,在所有已知的方法中,还没有同时满足快速、简便、高效及提取的EV形态、纯度、产量和生物活性均符合后续实验要求的方法。目前商品化的沉淀试剂盒提取外泌体速度快,产量高,但是价格较为昂贵,试剂残留较多,有一定的细胞毒性,对后续的功能试验影响较大。只有将现有的提取方法进行整合,才能有效降低样本中的杂质[4]。目前普遍应用的提取外泌体的方法主要是针对外泌体内生物活性物质的研究,一旦将其应用于临床治疗,寻找有效提高外泌体纯度和产量的方法亟待解决。图1、表2汇总了目前常用分离方法的工作原理和优缺点。
表2 分离EV常用方法比较 |
| 分离方法 | 工作原理 | 优点 | 缺点 |
|---|---|---|---|
| 超速离心法 | 分离基于EV的大小,大的（灰色）较早沉淀在管底,而小的（绿色）需更大的离心力才能沉淀。可溶性组分不受离心影响,但是非EV颗粒如脂蛋白和蛋白质聚集体可能会一同沉淀 | 分离外泌体纯度较高,是目前分离外泌体的金标准,最为常用 | 仪器昂贵,技术难度高,耗时费力,产量低,重复离心操作可能对EV造成破坏,影响质量 |
| 密度梯度离心法 | 分离基于EV的密度,可从不同密度的颗粒分离出EV,EV将移动至其平衡密度,而高密度的可溶性组分将在管底沉淀 | 可从其他囊泡、颗粒和污染物中分离低密度EV,获得的EV纯度较高 | 步骤繁琐,耗时,对离心时间极为敏感 |
| 分子体积排除色谱法 | 基于EV分子的大小用多孔凝胶基质（虚线圆圈）进行分离。可溶性组分和粒径小于临界值的颗粒进入多孔基质,而大于临界值的EV和颗粒不进入多孔基质,快速洗脱出。此法可精确分离大、小分子 | 此法分离的EV纯度较高,在电镜下大小均一,不受可能改变囊泡结构的剪切力影响 | 需要特殊的设备,耗时费力,获取量少,应用不广泛 |
| 超滤法 | EV大于一般的蛋白质,利用不同截留相对分子质量的超滤膜对样品进行选择性分离,可溶性蛋白质和小于临界值（约105 kDa）的颗粒被推向过滤膜,然后在过滤膜处收集EV | 简单高效,可将EV与小颗粒和可溶性分子分离,且不影响其生物活性 | EV可能附着在过滤膜上流失,超滤过膜时加压可引起EV变形或破坏,可能受蛋白污染 |
| 免疫吸附法 | 基于EV表面特异性标记物,用包被相应抗体的磁珠与EV共同孵育后,即可将EV吸附并分离出来。图示中使用针对暴露在目标（绿色）EV上抗原的单克隆抗体捕获EV | 操作简单,特异性高,不影响EV形态完整,纯度尚可,得到的EV直接用于分析或用于DNA或总RNA分离 | 效率低,外泌体生物活性易受pH和盐浓度影响,不利于下游实验,抗体价格昂贵且不可回收,不适合从大量样本获得EV |
| 沉淀法 | 基于聚合物的沉淀剂与疏水性蛋白和脂质分子结合共沉淀来分离EV,非EV颗粒和可溶性蛋白质也可被聚集沉淀。最常见的聚合物之一是聚乙二醇 | 操作简便,技术难度低,耗时短 | 纯度和回收率低,杂蛋白较多（假阳性）,颗粒大小不均一,产生难以去除的聚合物,机械力或者吐温-20℃等化学添加物将会破坏外泌体 |
除了上述方法外,还有一些学者尝试用离子体共振生物传感器、纳米脂质探针系统、微流控系统、基于胆固醇含量的热辅助声流体分离囊泡的技术、旋转超滤技术、免疫修饰的超顺磁性纳米颗粒等技术,为快速、高效和高纯度的EV分离和洗脱提供新的途径,进而有益于外泌体的应用[6]。
三、鉴定方法
目前对EV（主要是外泌体）的鉴定方法包括形态学、粒子大小、表面标志物等方面,分述如下：
1. 基于抗体的鉴定方法
鉴于EV是在细胞膜通路中产生的,因此与此通路相关的抗体靶向标记可以对其进行鉴定。其中包括四跨膜蛋白超家族（CD9、CD63和CD81）、AIP1/Alix、TSG101和CD326/EPCAM[9]。蛋白鉴定的方法可使用蛋白免疫印迹法。这一方法可与以下所述的一些技术结合使用,以确定EV的种群。
2. 透射电镜
透射电镜可用于观察EV的表面特征。将纯化的EV置于悬浮液中,放在显微镜样品格上,用醋酸铀和纤维素进行阴性染色后,透射电镜可清晰地显示EV的形态。镜下观察,EV呈现双层膜包裹的囊泡结构,常被描述为“杯子形状”,然而这也可能是处理样品时因烘干造成的假象。因此,这一方法不应作为EV的一个明确特征,也不能用于EV来源的鉴定。
3. 根据粒子大小的鉴定方法
根据粒子大小对EV进行鉴定最常用方法之一是NanoSight纳米粒子跟踪分析技术（NTA）。这一技术是在光学显微镜上安装了高清摄像机,利用光散射和布朗运动的性质,通过斯托克斯-爱因斯坦方程（纳米颗粒在其悬浊液中单位时间内的移动速度与其本身的粒度、溶液的粘度和温度存在数量上的关系）,对50 ~ 1000 nm直径范围内特定的外泌体和微囊泡进行逐个直接成像和观察,得到与之相关的高分辨率的粒度分布数据和浓度信息,可用于外泌体的半定量检测。与透射电镜不同,不需要干燥、固定以及冷冻等检测前处理,NTA可实现原位、更接近其原始状态下测试,对EV颗粒可提供结构与功能上的保护,保证了测量数据的真实性和有效性。
上述方法需要的样本量非常小,而且具有可靠、半定量、快速和易用等优点。值得注意的是,这些方法不能确定EV的来源,而且可能包括膜和其他细胞的碎片,或脂蛋白复合物。因此,这些技术应与其他更多的“定性”技术相结合,特别是电镜,来对EV进行鉴定。
4. 流式细胞仪
5. 荧光和共聚焦显微技术
6. 其他方法
其他检测单个EV的方法有原子力显微镜、场发射扫描电子显微镜、拉曼光谱分析、微核核磁共振、小角度X射线散射、反常SAXS和电阻脉冲传感等[19]。
上述鉴定方法可结合使用,根据国际EV协会于2014年发表的一个指导手册,建议鉴定外泌体首先需要通过蛋白免疫印迹法来鉴定EV的标志蛋白是否存在于样品中,然后通过电子显微镜来观察样品中EV的形态特征,通过NTA等手段来分析样品中EV的群体特征（粒子浓度、直径分布等）。其他方法可根据研究需要决定是否应用。
综上所述,EV作为广泛存在的、参与细胞间信息传递的生物活性物质,在生理、病理过程中发挥重要作用。作为近年来研究的新兴领域,EV的分类、产生机制、特征也逐渐被认识,然而,由于EV体积小、密度低,其分离、鉴定难度大,是制约研究和转化的重要因素。结合不同机理的分离和鉴定方法,以及开发更为高效、便捷的技术,是解决EV研究的重要途径。