随着医学技术的进步,胆总管结石治疗现状不断得到改善,大多数胆总管结石可通过经内镜逆行性胰胆管造影术（ERCP）取石治愈[1]。但是,胆总管结石取石术后的复发仍然是临床深受困扰的问题[2]。因此,探索有效措施减低胆总管结石较为重要。胆总管结石患者存在不同程度的感染,感染可能引起胆道微生物的变化与细菌感染,对胆总管结石的发病和病情造成影响。已有研究表明,胆道微生物情况与胆总管结石具有密切的联系[3]。胆道微生物的异常可能对脂多糖、细菌蛋白的分泌产生影响,而这些物质可能与胆结石的形成和发展具有联系。故了解复发型胆总管结石患者的胆道微生物特征,分析微生物对胆总管结石患者复发的影响很有必要。但是,目前胆道微生物学对复发型胆总管结石的影响机制仍不明确,且临床尚缺乏复发型胆道微生物学特征的大样本研究。基于此,观察复发型胆总管结石患者胆道微生物的特征,并分析胆道微生物对胆总管结石复发的影响,以明确胆道微生物是否对复发型胆总管结石具有预测价值,对指导后续干预以降低复发率有重要意义。
对象与方法
一、研究对象
回顾性分析2017年1月至2019年12月本中心接受ERCP并于术后1年随访的40例复发型胆总管结石患者的临床资料（复发型组）,收集同期于本中心接受ERCP并于术后1年随访的40例非复发型胆总管结石患者临床资料（非复发型组）作为对照。本研究的纳入标准：①经磁共振胰胆管造影、腹部CT或腹部B超等检查确诊为胆总管结石;②均接受ERCP且取石成功;③首次行ERCP,且术后随访1年;④手术成功后均复诊,复发型组（随访1年内复发1次及以上）通过复诊确诊,确诊标准参照①;⑤在术中使用造影剂之前均已顺利抽取胆汁样本。排除标准：①术前3 d内接受抗生素治疗;②合并胃肠系统、呼吸系统、泌尿生殖系统等感染;③临床资料和影像学资料不完整。本研究获广东省第二人民医院医学伦理委员会的批准。所有患者对本次研究内容知情并签署知情同意书。2组一般资料均衡性良好（P均> 0.05）,具有可比性,见表1。
表1 复发型组与非复发型组一般资料比较 |
| 项 目 | 复发型组（40例） | 非复发型组（40例） | t/x2值 | P值 |
|---|---|---|---|---|
| 性别（男/女,例） | 25/15 | 23/17 | 0.208 | 0.648 |
| 年龄（岁） | 53.43±6.45 | 53.39±6.22 | 0.028 | 0.978 |
| BMI（kg/m2） | 22.43±0.87 | 22.38±0.91 | 0.251 | 0.802 |
| 病程（年） | 4.46±1.46 | 4.54±1.47 | 0.244 | 0.808 |
| 平均胆总管直径（mm） | 15.35±1.13 | 15.41±1.07 | 0.244 | 0.808 |
| 胆总管结石数量（1/2个,例） | 14/26 | 16/24 | 0.213 | 0.644 |
| 胆总管结石大小（mm） | 12.43±2.16 | 12.39±2.09 | 0.084 | 0.933 |
二、资料收集
1. 收集胆汁样本资料
行ERCP时,在注入造影剂之前,冲洗十二指肠镜钳道,使用胆道导管收集2 ~ 8 ml胆汁并通过无菌管留存于-80℃下,将患者基本信息以及同期血清胆汁酸水平记录于管壁。
2. 菌种培养与鉴定
三、统计学处理
采用SPSS 24.0处理数据,计量资料均经正态性检验,呈正态分布,以$\overline{x}±s$表示,组间比较用独立样本t检验;计数资料用百分比表示,采用x2检验,胆道微生物与复发型胆总管结石的关系采用多因素logistic回归分析（逐步法）,绘制受试者工作特征（ROC）曲线得到曲线下面积（AUC）,检验胆道微生物数量对复发型胆总管结石的预测价值,AUC值 > 0.90表示预测性能较高,0.71 ~ 0.90表示有一定的预测性能,0.50 ~ 0.70表示预测性能较差, < 0.50表示无预测性能,采用MedCalc软件通过DeLong检验比较各指标AUC的差异。P < 0.05为差异有统计学意义。
结果
一、胆道微生物培养结果
培养结果显示,复发型组革兰阴性菌、革兰阳性菌和真菌各25株、11株和1株,占比分别为67.57%、29.73%和2.70%;非复发型组革兰阴性菌、革兰阳性菌和真菌各25株、8株和0株,占比分别为75.76%、24.24%和0.00%,合计33株。复发型组的革兰阴性菌株数与非复发型组相同,复发型组的革兰阳性菌和真菌多于非复发型组（x2 = 0.573,P = 0.449）。其中复发型组占比由高到低的前4种分别为大肠埃希菌、肠球菌、金黄色葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌;非复发型组占比由高到低的前4种分别为大肠埃希菌、痤疮丙酸杆菌、肠球菌、金黄色葡萄球菌,见表2。
表2 复发型组与非复发型组病原菌结果及构成比[株（%）] |
| 病原菌 | 复发型组（40例） | 非复发型组（40例） | ||
|---|---|---|---|---|
| 株数 | 构成比 | 株数 | 构成比 | |
| 革兰阴性菌 | 25 | （67.57） | 25 | （75.76） |
| 大肠埃希菌 | 12 | （32.43） | 11 | （33.33） |
| 痤疮丙酸杆菌 | 5 | （13.51） | 4 | （12.12） |
| 肺炎克雷伯菌 | 2 | （5.41） | 3 | （9.09） |
| 铜绿假单胞菌 | 2 | （5.41） | 3 | （9.09） |
| 奇异变形菌 | 2 | （5.41） | 2 | （6.06） |
| 普通变形菌 | 2 | （5.41） | 2 | （6.06） |
| 革兰阳性菌 | 11 | （29.73） | 8 | （24.24） |
| 肠球菌 | 6 | （16.22） | 4 | （12.12） |
| 金黄色葡萄球菌 | 5 | （13.51） | 4 | （12.12） |
| 真菌 | 1 | （2.70） | 0 | （0.00） |
| 白色假丝酵母菌 | 1 | （2.70） | 0 | （0.00） |
二、胆道微生物特征
复发型组大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、肠球菌、痤疮丙酸杆菌数量大于非复发型组,差异均有统计学意义（P均< 0.05）,见表3。
表3 复发型组与非复发型组胆道微生物特征比较（$\overline{x}±s$） |
| 组 别 | 大肠埃希菌 （×105cfu/ml） | 金黄色葡萄球菌 （×104cfu/ml） | 肠球菌 （×106cfu/ml） | 痤疮丙酸杆菌 （×103cfu/ml） |
|---|---|---|---|---|
| 复发型组（40例） | 1.88±0.31 | 6.16±0.89 | 6.48±1.27 | 9.55±1.33 |
| 非复发型组（40例） | 1.40±0.39 | 5.18±0.65 | 5.24±0.68 | 7.63±1.64 |
| t值 | 6.094 | 5.624 | 5.444 | 5.571 |
| P值 | < 0.001 | < 0.001 | < 0.001 | < 0.001 |
三、胆道微生物对复发型胆总管结石的影响
将大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、肠球菌、痤疮丙酸杆菌数量作为自变量,将胆总管结石复发情况作为因变量（1 =复发型胆总管结石,0 =非复发型胆总管结石）,经logistic回归分析结果显示,大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、肠球菌、痤疮丙酸杆菌均是复发型胆总管结石的影响因子（OR均> 1,P均< 0.05）。见表4。
表4 胆道微生物对复发型胆总管结石的影响的多因素logistic回归分析结果 |
| 因 素 | B | SE | WaId | P | OR | 95%CI |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 大肠埃希菌 | 5.895 | 2.128 | 7.673 | 0.006 | 363.061 | 5.605 ~ 23 515.325 |
| 金黄色葡萄球菌 | 3.415 | 1.255 | 7.405 | 0.007 | 30.405 | 2.599 ~ 355.653 |
| 肠球菌 | 2.579 | 0.966 | 7.131 | 0.008 | 13.185 | 1.986 ~ 87.534 |
| 痤疮丙酸杆菌 | 1.302 | 0.493 | 6.963 | 0.008 | 3.677 | 1.398 ~ 9.674 |
四、胆道微生物对复发型胆总管结石的预测作用
表5 胆道微生物预测复发型胆总管结石的ROC分析结果 |
| 检验变量 | AUC | AUC的95%CI | 标准误 | P | 最佳阈值 （cfu/ml） | 灵敏度 | 特异度 | 约登指数 | 与大肠埃希菌比较的P值 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 大肠埃希菌 | 0.813 | 0.718 ~ 0.909 | 0.049 | < 0.001 | 1.245×105 | 0.950 | 0.550 | 0.500 | |
| 金黄色葡萄球菌 | 0.809 | 0.715 ~ 0.904 | 0.048 | < 0.001 | 4.370×104 | 0.975 | 0.850 | 0.825 | 0.324 |
| 肠球菌 | 0.807 | 0.712 ~ 0.901 | 0.048 | < 0.001 | 4.370×106 | 0.975 | 0.900 | 0.875 | 0.283 |
| 痤疮丙酸杆菌 | 0.806 | 0.711 ~ 0.902 | 0.049 | < 0.001 | 7.335×103 | 0.975 | 0.600 | 0.575 | 0.165 |
讨论
在胆道镜、微创手术等技术发展下,胆总管结石治疗方式更多,胆总管结石患者的治疗现状得到改善。但是,术后胆总管结石的复发仍然是困扰胆道外科医师的难题之一[6]。目前,胆总管结石复发影响因素的相关研究较少,研究复发型胆总管结石特点,找到可能的影响因子,并制定合理的干预计划以减少复发是目前亟待解决的问题。
胆道微生物对胆总管结石的发生发展有一定的影响[7]。正常情况下,人体胆道内无细菌生长,但胆总管结石患者在无症状期或并发胆道感染时,胆汁内可能存在来自肠道的致病菌[8]。而胆汁内致病细菌的存在会破坏胆道微生态平衡,且可能成为促进胆总管结石形成和触发胆总管结石所致胆道感染反复发生的因素。因此,对复发型胆总管结石患者的胆道微生态情况进行观察具有重要意义。本研究结果显示,复发型组胆总管结石患者的胆道微生物变化异常,大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、肠球菌、痤疮丙酸杆菌水平高于非复发型组胆总管结石患者。初步推测大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、肠球菌、痤疮丙酸杆菌异常增殖可能是影响胆总管结石复发的因素。进一步行logistic回归分析并绘制ROC曲线结果显示,大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、肠球菌、痤疮丙酸杆菌增殖是复发型胆总管结石的影响因子;大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、肠球菌、痤疮丙酸杆菌检测用于预测复发型胆总管结石均有一定价值。
本研究显示复发型胆总管结石患者的胆道微生物病原菌变化异常显著,提示其可能参与了结石的发生与复发,推测可能的原因与机制如下：①胆道菌群异常可能引起的慢性炎症会促进结石的形成[9]。胆道环境中存在营养限制、胆汁酸等极端因素,这些因素对细菌的生长与繁殖造成了障碍[10]。然而,大肠埃希菌、肠球菌、金黄色葡萄球菌等细菌会利用胆汁酸形成细胞壁缺陷型变体,即L型细菌,以生存于胆道系统中[11]。L型细菌的抗原性、致病力较弱,因此可免受机体免疫系统的攻击,但这类细菌对细菌细胞壁特异性抗生素的敏感性具有特殊性,因此可以留存于人体的胆道系统中[12,13]。由于致病细菌的存在,机体胆道逐渐发生慢性炎症,而这种状态有利于结石形成[14,15]。②大肠埃希菌、肠球菌、金黄色葡萄球菌等细菌可以通过形成生物膜的形式使自身受到保护并留存在胆道中[16]。Ma等（2020年）的研究显示,大肠埃希菌有利于结石的形成,由此推测,大肠埃希菌是胆总管结石复发的影响因素。③细菌源性的β-葡萄糖醛酸苷酶已被证实为棕色色素结石形成的重要原因之一。而Awolade等（2020年）证实大肠埃希菌的邻硝基苯酚可以产生β-葡萄糖醛酸苷酶,胆道中大肠埃希菌的增殖可引起β-葡萄糖醛酸苷酶水平升高,因而促进了胆总管结石的形成。④大肠埃希菌、肠球菌、金黄色葡萄球菌等细菌促进卵磷酯降解为硬脂酸、软脂酸,推进了分解物的钙结合进程,形成不溶的结晶,造成胆总管结石的复发。除上述因素外,Dréno等（2018年）发现从胆固醇结石中检出的痤疮丙酸杆菌数目较多,提示痤疮丙酸杆菌可能在胆固醇结石的形成和发展中起一定作用。痤疮丙酸杆菌的非特异性细胞外脂酶可对甘油三酯水解过程进行催化,从而促使游离脂肪酸产生和卵磷脂被消耗,而游离脂肪酸可促进结石形成,继而导致结石复发;另外,痤疮丙酸杆菌可分泌亲脂性较强的磷脂酶C,对胆汁泡及微胶粒团的稳定性造成破坏,从而促进胆总管结石的形成或疾病的发展。
综上所述,复发型胆总管结石患者胆道微生物存在明显变化,病原微生物的检出率高于非复发型组,如大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、肠球菌、痤疮丙酸杆菌等,这些病原微生物的增殖可能与胆总管结石的发生及复发有关,建议对初次接受治疗的胆总管结石患者治疗后密切关注其胆道微生物变化情况,对检出上述病原微生物的患者应及时采取措施调节,可能对减少胆总管结石复发有积极意义。