宫颈癌是一种原发于子宫颈部位的恶性肿瘤，是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一[1]。以手术、放射治疗为主的综合治疗是进展期宫颈癌的主要治疗手段，其中放射治疗除根治性治疗作用外，还可作为手术后的辅助治疗，预防肿瘤的局部复发[2]。然而，超过50%的宫颈癌患者在放射治疗后会发生放射性肠炎（RE），出现腹痛、急性腹泻、恶心、食欲不振等肠道损伤症状，严重影响患者生活质量[3]。对RE发生的机制研究发现，除电离辐射造成的上皮损伤外，肠道免疫系统、肠道微生物等多种因素的相互作用，也是诱发RE的重要原因[4]，但有关进展期宫颈癌放射治疗患者免疫功能、肠道微生物与RE的关系有待进一步研究。本研究通过分析进展期宫颈癌放射治疗患者免疫功能、肠道微生物特征与RE的关联性，旨在为临床RE的防治提供参考依据。
对象与方法
一、研究对象
收集2020年3月至2022年3月在本科行放射治疗的80例进展期宫颈癌患者临床资料。纳入标准：①临床检查符合宫颈癌的相关诊断标准，进展期为Ⅱb~Ⅳa期；②年龄> 18岁；③均接受根治性放射治疗或术后放射治疗[5]。排除标准：①有肠道疾病、代谢疾病或免疫缺陷病史患者；②合并其他恶性肿瘤患者；③长期使用糖皮质激素或免疫抑制剂患者；④有消化道手术史患者。根据放射治疗后3个月内是否发生RE将患者分为RE组（29例）和非RE组（51例）。本研究经医院伦理委员会批准（批件号：院伦理审〔2023〕006号），入组患者均已签署知情同意书。
二、方法
1. RE评估与分级标准
治疗期间每周监测患者的不良反应，患者出现便血，同时合并便频、便秘、黏液粪便等症状时，可确诊为RE。根据常见不良反应标准5.0版（CTCAE5.0）对RE的严重程度进行分级[6]。RE组中，1级RE患者18例（低症状级别组），2~3级RE患者11例（高症状级别组），无4级及以上RE发生。
2. 免疫功能评估
所有患者均于放射治疗前1周内、放射治疗第2周结束次日取空腹静脉血5 mL，采用美国贝克曼库尔特有限公司CytoFLEX型流式细胞仪检测T淋巴细胞亚群（CD3+、CD4+/CD8+）和B淋巴细胞比例。
3. 肠道微生物特征分析
3.1 样本收集与16S rDNA测序
于放射治疗前1周内、放射治疗第2周结束次日采集患者粪便。采用DNA提取试剂盒（QIAamp Power Fecal DNA Kit）提取粪便样本中的细菌基因组DNA。根据细菌的16S核糖体RNA（16S rRNA）基因序列设计V4区通用引物，对微生物核糖体RNA的V4基因片段进行PCR扩增，扩增产物行磁珠纯化回收后荧光定量，使用Illumina Miseq平台进行双端测序。
3.2 生物信息学分析
使用QIIME软件完成生物信息学分析，所得结果用于操作分类单元（OTU）的聚类分析和物种分类注释。基于OTU分析结果进行α多样性分析，获得Observed species指数、Chao1指数、Shannon指数和Simpson指数；采用Bray-curtis、unweighted unifrac和weighted unifrac三种距离矩阵PCoA分析法进行β多样性分析。
三、统计学处理
采用SPSS 20.0对数据进行分析。计量资料采用Kolmogorov-Smirnov法进行正态性检验，符合正态分布的计量资料以表示，组间比较行独立样本t检验，组内治疗前后比较行配对t检验；计数资料以例（%）表示，组间比较行χ 2检验或Fisher确切概率法。α=0.05。
结果
一、RE组和非RE组患者的一般临床资料分析
RE组和非RE组的一般临床资料比较差异均无统计学意义（P均> 0.05）。见表1。
表1 RE组和非RE组患者一般临床资料比较（$ \bar{x} \pm s $） |
| 指 标 | RE组（29例） | 非RE组（51例） | t/ χ 2值 | P值 |
|---|---|---|---|---|
| 年龄/岁 | 54.63±8.64 | 53.79±8.85 | 0.412 | 0.682 |
| BMI/（kg/m2） | 23.57±1.84 | 24.01±1.52 | 1.152 | 0.253 |
| KPS评分/分 | 79.56±6.28 | 82.13±6.89 | 1.655 | 0.102 |
| 病理分型/例（%） | — | 1.000a | ||
| 鳞状细胞癌 | 26（90） | 46（88） | ||
| 非鳞状细胞癌 | 3（10） | 6（12） | ||
| 分期/例（%） | 0.190 | 0.909 | ||
| Ⅱb期 | 8（28） | 14（27） | ||
| Ⅲa期 | 13（45） | 25（49） | ||
| Ⅲb期 | 8（28） | 12（24） | ||
| 治疗方式/例（%） | 0.435 | 0.509 | ||
| 根治性同步放射治疗 | 19（66） | 37（73） | ||
| 术后辅助性放射治疗 | 10（34） | 14（27） | ||
| 是否同步化疗/例（%） | 0.197 | 0.657 | ||
| 是 | 15（52） | 29（57） | ||
| 否 | 14（48） | 22（43） |
注：aFisher确切概率法。 |
二、RE组和非RE组的免疫功能比较
放射治疗前后，RE组患者的CD4+/CD8+比值、B淋巴细胞比例低于非RE组（P < 0.05）。见表2。
表2 RE组和非RE组免疫功能比较（$\bar{x} \pm s$） |
| 组 别 | 例数 | CD3+/% | CD4+/CD8+ | B淋巴细胞/% | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 放射治疗前 | 放射治疗后 | 放射治疗前 | 放射治疗后 | 放射治疗前 | 放射治疗后 | ||||
| RE组 | 29 | 72.51±7.34 | 73.64±8.04 | 1.33±0.17 | 1.21±0.19 | 6.78±1.35 | 5.24±1.26 | ||
| 非RE组 | 51 | 75.47±7.21 | 74.28±6.95 | 1.84±0.19 | 1.63±0.21 | 10.12±0.84 | 8.31±1.59 | ||
| t值 | 1.754 | 0.374 | 11.978 | 8.894 | 13.652 | 8.919 | |||
| P值 | 0.083 | 0.710 | <0.001 | <0.001 | <0.001 | <0.001 | |||
三、RE组中不同分级患者的免疫功能比较
无论是放射治疗前还是放射治疗后，RE组中的低症状级别组患者CD4+/CD8+、B淋巴细胞比例均高于高症状级别组（P < 0.05）。见表3。
表3 RE组中不同分级患者免疫功能比较（$\bar{x} \pm s$） |
| 组 别 | 例数 | CD3+/% | CD4+/CD8+ | B淋巴细胞/% | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 放射治疗前 | 放射治疗后 | 放射治疗前 | 放射治疗后 | 放射治疗前 | 放射治疗后 | ||||
| 低症状级别组 | 18 | 72.25±8.17 | 73.51±7.52 | 1.42±0.15 | 1.32±0.17 | 7.51±1.25 | 5.61±1.03 | ||
| 高症状级别组 | 11 | 72.93±6.94 | 73.86±6.83 | 1.19±0.13 | 1.03±0.16 | 5.59±1.49 | 4.64±1.15 | ||
| t值 | 0.230 | 0.126 | 4.205 | 4.555 | 3.733 | 2.356 | |||
| P值 | 0.820 | 0.901 | <0.001 | <0.001 | 0.001 | 0.026 | |||
四、RE组和非RE组的肠道微生物α多样性比较
无论是放射治疗前还是放射治疗后，非RE组患者的Chao1指数、Shannon指数和Simpson指数均高于RE组（P < 0.05）。见表4。
表4 RE组和非RE组肠道微生物α多样性比较（$\bar{x} \pm s$） |
| 组 别 | 例数 | Chao1指数 | Shannon指数 | Simpson指数 | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 放射治疗前 | 放射治疗后 | 放射治疗前 | 放射治疗后 | 放射治疗前 | 放射治疗后 | ||||
| RE组 | 29 | 314.45±68.83 | 331.57±35.19 | 3.15±1.01 | 4.01±0.99 | 0.30±0.09 | 0.48±0.11 | ||
| 非RE组 | 51 | 351.64±70.35 | 359.79±40.64 | 3.84±0.98 | 4.54±1.02 | 0.36±0.10 | 0.56±0.12 | ||
| t值 | 2.291 | 3.130 | 2.994 | 2.258 | 2.673 | 2.952 | |||
| P值 | 0.025 | 0.003 | 0.004 | 0.027 | 0.009 | 0.004 | |||
五、RE组和非RE组肠道微生物β多样性比较
无论是放射治疗前还是放射治疗后，放射治疗前后，RE组和非RE组患者的肠道微生物的β多样性比较差异均无统计学意义（P > 0.05）。见表5。
表5 RE组和非RE组肠道微生物β多样性比较（$\bar{x} \pm s$） |
| 组 别 | 例数 | Bray-curtis distance | unweighted unifrac distance | weighted unifrac | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 放射治疗前 | 放射治疗后 | 放射治疗前 | 放射治疗后 | 放射治疗前 | 放射治疗后 | ||||
| RE组 | 29 | 0.85±0.21 | 0.91±0.24 | 0.53±0.19 | 0.56±0.15 | 0.32±0.17 | 0.33±0.12 | ||
| 非RE组 | 51 | 0.89±0.25 | 0.86±0.27 | 0.57±0.18 | 0.61±0.17 | 0.35±0.15 | 0.36±0.13 | ||
| t值 | 0.727 | 0.828 | 0.936 | 1.318 | 0.819 | 1.020 | |||
| P值 | 0.469 | 0.410 | 0.352 | 0.191 | 0.415 | 0.311 | |||
六、RE组和非RE组肠道微生物组成及差异分析
2组的肠道微生物组成中具有明显差异的菌属主要为硬壁菌门和互养菌门。放射治疗前及放射治疗后，RE组氨基酸球菌属（Acidaminococcus）、戴阿利斯特杆菌属（Dialister）相对丰度高于非RE组，锥形杆菌属（Pyramidobacter）相对丰度低于非RE组（P < 0.05）。见表6。
表6 RE组和非RE组肠道微生物相对丰度比较（$\bar{x} \pm s$） 单位：log2丰度 |
| 组 别 | 例数 | Acidaminococcus | Dialister | Pyramidobacter | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 放射治疗前 | 放射治疗后 | 放射治疗前 | 放射治疗后 | 放射治疗前 | 放射治疗后 | ||||
| RE组 | 29 | 2.17±0.61 | 2.39±0.48 | 6.31±1.01 | 7.29±1.26 | 1.19±0.31 | 1.73±0.42 | ||
| 非RE组 | 51 | 1.35±0.43 | 1.93±0.52 | 5.26±1.15 | 5.67±1.34 | 2.38±0.75 | 2.67±0.73 | ||
| t值 | 7.022 | 3.909 | 4.098 | 5.310 | 8.140 | 6.352 | |||
| P值 | <0.001 | <0.001 | <0.001 | <0.001 | <0.001 | <0.001 | |||
讨论
放射治疗作为恶性肿瘤的主要治疗手段，在控制疾病进展、改善患者预后方面，具有重要意义。临床研究证实，放射治疗的疗效主要取决于照射剂量的准确性，但由于肠道的可耐受剂量远远低于靶病灶的治疗剂量，放射治疗期间RE仍是困扰宫颈癌患者的一大问题[7]。尽管三维适形放射治疗、调强适形放射治疗等技术逐渐成熟，但RE的发生率仍无明显改善。提前预测RE的发生并采取支持性的治疗，是降低RE发生风险、提高患者生活质量的关键。
本研究显示，与非RE组相比，RE组放射治疗前后的CD4+/CD8+比值、B淋巴细胞比例均下降，提示细胞免疫功能失衡与宫颈癌放射治疗患者RE的发生有关。B淋巴细胞具有更高的辐射敏感性，在放射治疗期间更易受到辐射线影响[8]。辐射一方面会杀灭肿瘤细胞，另一方面会导致肠黏膜免疫调节功能失调，增加放射治疗后RE的发生风险[9]。胡格等[10]的研究也发现，宫颈癌患者CD4+/CD8+比值越低、B淋巴细胞比例下降越明显，患者放射治疗后出现RE的概率越高。本研究显示，免疫功能失衡越严重，患者更易发生较为严重的RE，考虑与肠黏膜免疫系统失衡诱导的过度炎症反应会损害肠屏障功能，导致吸收障碍和血管损伤，使肠壁黏膜苍白、脆弱，最终坏死有关[11]。
王中秋等[12]研究发现，特定菌群丰度的改变，会使机体处于慢性炎症反应状态，影响屏障完整性与免疫功能，从而促进肠道疾病的发生发展。本研究显示，发生RE的宫颈癌患者，其肠道微生物多样性较低。分析原因可能为辐射使肠壁萎缩、肠黏膜损伤，导致肠道分泌功能减退，使肠道菌群分布发生改变，引起肠道微生态失衡，最终导致肠道微生物多样性降低[13]。本研究中，2组患者的肠道微生物β多样性比较无明显差异，这与既往研究结果不同，考虑与患者个体差异、辐射时长不同等有关[14]。在肠道微生物组成方面，本研究显示，发生RE的宫颈癌患者肠道微生物Acidaminococcus、Dialster和Pyramidobacter丰度水平发生明显改变。Acidaminococcus、Dialister是定植于人类肠道的正常菌群，均属于机会致病菌，二者的富集与肠道功能障碍密切相关[15]。Pyramidobacter多数为厌氧菌，其代谢产物丁酸盐可诱导结肠癌细胞凋亡，并能通过影响结肠上皮细胞的新陈代谢，发挥维持肠道微生态平衡的作用[16]。据此可推测，RE患者在Acidaminococcus、Dialister和Pyramidobacter等属水平上丰度的改变，可能会诱发肠黏膜炎症反应，导致大量炎性因子释放的释放，从而激活炎症通路，使黏膜屏障被破坏，从而出现腹痛、腹泻、便血等临床症状。
综上所述，进展期宫颈癌放射治疗患者CD4+/CD8+比值、B淋巴细胞比例和肠道微生物特征与RE密切相关，治疗期间CD4+/CD8+比值、B淋巴细胞比例下降和肠道微生态失衡的患者更容易发生RE。